Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l'analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

La zone ventriculaire-ventriculaire murin (V-SVZ), dans les parois du ventricule latéral face au striatum, est une région germinal très actif dans lequel un processus continu de réplication de cellules souches et de différenciation des résultats dans la production persistante du bulbe olfactif (OB ) interneurones et les oligodendrocytes corps calleux ^1. La génération permanente de ces cellules semble être soutenu par la présence dans la région de cellules neuronales souches (les NSC, également appelées cellules B1), qui expriment l'antigène astrocytaire protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et de la tige marqueurs cellulaires tels que la nestine, Id1 et Sox2 ^2. GFAP cellules exprimant B1 génèrent transit amplifier progénitrices (TAP) (cellules C), qui expriment les facteurs de transcription Dlx2 (distal-less homeobox 2) et Ascl1 (mammifère Achaete-Schute homologue 1) et de diviser rapidement un certain nombre de fois avant qu'ils ne donnent lieu à la migration des neuroblastes (cellules A) ou oligodendroblasts ^3. Nouvellement généré prolifneuroblastes ratives migrent en avant, formant le courant de migration rostrale (RMS) de l'OB, où ils intègrent dans le granulaire et couches glomérulaire interneurones inhibiteurs différenciés. Migration jeunes oligodendroblasts passer à la CC, où ils deviennent des cellules NG2 positif immatures qui continuent de diviser localement ou se différencier en oligodendrocytes myélinisantes matures ^1,4.

cellules B1, qui dérivent de cellules gliales radiales fœtales, conservent la morphologie allongée et polarisée de leurs prédécesseurs et présentent une relation hautement spécialisée avec leur niche. Ils couvrent entre l'épendyme qui aligne le ventricule et le réseau de vaisseaux sanguins qui irriguent le créneau de la V-SVZ. Le petit processus apicale des cellules B1 intercale entre ependymocytes multiciliées et se termine en un seul cil primaire non mobiles, alors que leur processus de base étend de longues distances pour approcher le plexus vasculaire plane qui irrigue ce créneau fin dans le basal lamina des capillaires du plexus ^2,5-8.

Le moyen le plus fiable de distinguer B1-NSCs des astrocytes non neurogène, qui sont aussi GFAP ^+, dans le créneau intacte de V-SVZ est basé sur l'ensemble du montage des préparations de la paroi latérale du ventricule et leur analyse par 3-D microscopie confocale après immunocoloration pour GFAP d'étiqueter la mince processus apical B1-NSC, β-caténine pour délimiter les membranes cellulaires, et soit γ-tubuline comme un marqueur de corps basaux ciliaire ou acétylée α-tubuline pour marquer la mesure de chaque cil ^5,8. Observations de ces entiers montures de la surface ventriculaire ont indiqué que les cellules B1 et épendymaires sont disposés en "soleils" ^5, dans lequel les processus apical uniciliated d'un ou de plusieurs GFAP ⁺ B1 cellules sont encerclés par une rosette de cellules épendymaires multiciliées.

La morphologie caractéristique des cellules B1 est en corrélation avec des données expérimentales indicating que les vaisseaux sanguins / cellules endothéliales et ventriculaire liquide céphalo-rachidien (LCR) constituent des sources réglementées de signaux solubles agissant sur ​​NSCs ^2,6,9-11. À la surface ventriculaire, homotypique et interactions apico-latérale hétérotypiques impliquant des cellules épendymaires et B1 inclure jonctions serrées et jonctions adhérentes ^5,12. En outre, les molécules d'adhésion impliquées dans les complexes de jonction entre les cellules B1 et épendymaires, tels que la N-cadhérine et V-CAM, il a été démontré pour réguler non seulement la mise en place très organisée de B1 dans le créneau de V-SVZ, mais aussi leur quiescence ^{12 , 13.} La monocouche de cellules épendymaires-B1 semble agir comme une barrière de diffusion permettant au flux régulé d'eau et de petites molécules à partir de la peste porcine classique, mais en limitant le passage de grosses protéines intercellulaire ^10,11. Des expériences montrent que la cellule B1 cil apical position unique pourrait jouer un rôle en tant que capteur de polypeptides présents dans le LCR ² de ^{signalisation,}7.5. Cellules épendymaires sont, en soi, une source de signaux solubles et membranaires avec un rôle dans la régulation du comportement NSC ^14,15.

Traçables nucleosides, tels que bromo-désoxyuridine (BrdU) ou des rétrovirus ont été largement utilisés pour marquer les cellules progénitrices, y compris NSC, in vivo. Cependant, ces procédés ne sont pas optimales pour le traçage destinée à long terme parce que les signaux de BrdU dilué par divisions cellulaires et des retrovirus répétées apparaissent de manière transitoire pour cibler préférentiellement les cellules d'amplification en raison de leur exigence de la prolifération cellulaire de transduction ^16,17. Pour examiner NSC physiologie in vivo, y compris les interactions avec des composants de niche, il est crucial d'établir une méthode d'étiqueter et de tracer les cellules en division rarement, comme B1-CSN sont en grande partie de repos et leurs cellules épendymaires voisins ne se divisent dans les conditions physiologiques ^3. Ici, nous montrons que les vecteurs lentiviraux (LV) permettent à haut rendement gène marquement et la modification à long terme du CNS adultes et les cellules épendymaires ne se divisant pas, en raison de la plus raisonnable de leur aptitude à la transduction et l'intégration dans le génome des cellules cibles d'une manière indépendante du cycle cellulaire. En outre, nous montrons comment la voie d'administration et virale titre d'aide pour la transduction spécifiquement les cellules épendymaires, mais pas les cellules B1 permettant ainsi l'analyse des effets, épendymaires de niche dépendant sur NSC.