This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
एक्यूट hippocampal टुकड़ा एलटीपी और इस तरह एसटीसी और पार पकड़ने के रूप में अन्य कार्यात्मक प्लास्टिसिटी प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है। यह हिप्पोकैम्पस सर्किट के लामिना संरचनात्मक नेटवर्क का ज्यादा सटीक, इलेक्ट्रोड स्थानों की अनुमति देता है और एक रक्त मस्तिष्क बाधा के बिना, के साथ-साथ तेजी से neuropharmacological हेरफेर के लिए एक खुला मंच प्रदान करता है बरकरार रखता है।
यह लेख युवा वयस्क चूहों से व्यवहार्य तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी के लिए कार्यप्रणाली का वर्णन करता है और एसटीसी और क्रॉस-टैगिंग की जांच करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं। पिछले अनुसंधान जानवरों की लिंग और उम्र इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पढ़ाई में उपयोग के लिए विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं कि जोर दिया है। पूरी तरह से व्यक्त वयस्क रिसेप्टर कार्यों (5-7 सप्ताह के आयु वर्ग के पुरुष Wistar चूहों) के साथ 27,28 इसलिए युवा वयस्क जानवरों का इस्तेमाल किया जाता है। 23 विषमताओं छोड़ दिया और सही हिप्पोकैम्पस के बीच कनेक्शन में कृन्तकों 29 में उल्लेख किया गया है औरNMDA रिसेप्टर अभिव्यक्ति में प्रमुख मतभेद अच्छी तरह से 34 के रूप में सूचित कर दिया गया है। हम फिर भी। हमारे पिछले एलटीपी पढ़ाई के साथ संगत होना करने के लिए 23,32 सही हिप्पोकैम्पस का इस्तेमाल किया है hippocampi के रूप में या तो लंबे समय तक निरंतरता बनाए रखा है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
किसी भी प्रोटोकॉल के रूप में, यह अलगाव और ऊतक, फैला क्षतिग्रस्त, सूखा या hypoxic नहीं गाया है कि जल्दी प्रक्रियाओं टुकड़ा करने की क्रिया है लेकिन देखभाल प्रदर्शन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। पीएच, तापमान और समाधान की आयनिक संरचना में बदलाव के स्लाइस और परिणामों की व्यवहार्यता पर गहरा असर पड़ सकता है। इसलिए इस तरह के बदलाव से परहेज किया जाना चाहिए। यह तैयारी चरणों के दौरान होने वाली ग्लूटामेट रिसेप्टर पर निर्भर कैल्शियम रिहाई अचल तंत्रिका ऊतक 35,36, 37 में प्रोटीन संश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं कि देखा गया है। मैनुअल ऊतक स्लाइसर का उपयोग करते हुए छठी की तुलना में बहुत जल्दी पूरा होने की प्रक्रिया की अनुमति देकर इस कम करने में मदद कर सकते हैंbraslicers। हालांकि, कई प्रयोगशालाओं भी प्रभावी ढंग से टुकड़ा व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए आवश्यक सावधानियों के साथ vibraslicers का उपयोग करें। विचार करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रयोगों के शुरू करने से पहले लंबे समय तक ऊष्मायन अवधि है। इस अशांति तैयारी 23 के दौरान की वजह से बाद स्लाइस में चयापचय राज्य और काइनेज सक्रियण के स्तर में स्थिरता प्राप्त करने के लिए वास्तव में महत्वपूर्ण होने के लिए उल्लेख किया गया है। इस तरह की स्थिरता लंबे समय तक रिकॉर्डिंग में स्थिरता के लिए आवश्यक है। हम इस अवलोकन पर फिर से जोर देना और के बारे में 3 घंटे की लंबी ऊष्मायन घंटे सुझाव देते हैं।
उत्तेजना मानकों की एक किस्म एलटीपी प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, लेकिन हर मामले में हासिल आणविक तंत्र (समीक्षा के लिए 38 देखें) ही नहीं हो सकता। यह स्थायित्व और बदले में, अन्तर्ग्रथनी टैगिंग और कब्जा प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, जो एलटीपी की अन्य विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए यह उत्तेजना मानदंड और विशेषताओं को मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैहासिल एलटीपी का प्रदर्शन कर प्रयोगशाला की परिस्थितियों में और स्थिरता बनाए रखने के लिए।
हम आम तौर पर बहुत बड़ी प्रेस्य्नाप्तिक फाइबर गलौज के साथ और अधिक से अधिक 0.5 एम वी से कम fEPSPs और रिकॉर्डिंग भी खारिज कर रहे हैं के दौरान फाइबर वॉली में काफी परिवर्तन से जुड़े प्रयोगों के साथ प्रयोगों पर विचार नहीं है। इसके अलावा, दो मार्ग या तीन मार्ग प्रयोगों प्रदर्शन, जबकि यह मार्ग स्वतंत्रता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक बनती पल्स सरलीकरण प्रोटोकॉल 28 के साथ किया जा सकता है।
इंटरफेस रिकॉर्डिंग सिस्टम का एक नकारात्मक पक्ष यह चैम्बर और आसपास के बीच तापमान और आर्द्रता के मतभेद के कारण लंबे समय रिकॉर्डिंग घंटों के दौरान इलेक्ट्रोड पर संक्षेपण बूंदों के गठन की है। इन बूंदों को ध्यान से समय-समय पर मिट जाने की जरूरत है। अन्यथा बूंदों स्लाइस पर ड्रिप और अशांति या संकेतों का भी नुकसान हो सकता है। हम आम तौर पर इस ख से निपटनेY खूबी इलेक्ट्रोड को छूने के बिना, एक पतला फिल्टर पेपर बाती का उपयोग कर खुर्दबीन के तहत निर्देशित बूंदों सोख्ता। हालांकि, सबसे अच्छा समाधान इस तरह के एडिनबर्ग विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं ने द्वारा विकसित प्रणाली आदि के रूप में एक केंद्रीय हीटिंग प्रणाली का उपयोग करने के लिए किया जाएगा।
एक समापन पर ध्यान दें, तरीकों की एक किस्म के विभिन्न प्रयोजनों के लिए प्रयोगात्मक हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में मौजूद हैं। प्रक्रिया का एक दूसरे पर कुछ लाभ प्रदान करता है। एक सावधानी से प्रयोग के उद्देश्य के अनुरूप करने के लिए प्रोटोकॉल के मिनट विवरण का अनुकूलन करने की जरूरत है। हम इस लेख में इस तरह एसटीसी और पार पकड़ने के रूप में देर से साहचर्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की पद्धति के कुछ पहलुओं में सुधार लाने में मदद करता है कि उम्मीद है।
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |