חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים
Summary
This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Abstract
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Introduction
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוסת היפוקמפוס חריפה היא מערכת מודל מצוינת ללימוד LTP ותהליכי פלסטיות תפקודיים אחרים כגון STC ולכידה צולבת. היא שומרת הרבה של הרשת המבנית מינרית של המעגלים בהיפוקמפוס, מאפשר מקומות אלקטרודה מדויקים ומציע לצד, פלטפורמה פתוחה למניפולציה neuropharmacological מהירה ללא מחסום דם-מוח.
מאמר זה מתאר את המתודולוגיה להכנת פרוסות בהיפוקמפוס חריפה קיימא מחולדות מבוגרות צעירות ומשתמש בהם כדי לחקור STC ותיוג צולב. המחקרים קודמים הדגישו כי מין וגיל של בעלי החיים הם גורמים חשובים להביא בחשבון לשימוש במחקרי אלקטרופיזיולוגיה. 27,28 בעלי חיים מבוגרים לכן צעירים עם פונקציות ביטוי מלא למבוגרים קולט (חולדות Wistar גברים בגילים 5-7 שבועות) משמשים. 23 סימטריות בקשרים בין ההיפוקמפוס השמאל וימין כבר ציין במכרסמים 29 והבדלים עיקריים בביטוי הקולטן NMDA דווחו גם כן 34. אנחנו השתמשנו בהיפוקמפוס הנכון כדי להיות בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו LTP. 23,32 עם זאת, אף אחד מhippocampi יכול לשמש עוד עקביות נשמר.
כמו בכל פרוטוקול, זה מאוד חשוב לבצע את הבידוד וטיפול חיתוך נהלים במהירות אבל לוקח שהרקמה לא נמתחה, פגום, שניתנו יבש או חוסר חמצן. השינויים ב- pH, טמפרטורה והרכב יוני של הפתרונות יכולים להיות השפעה עמוקה על יכולת הקיום של הפרוסות ואת התוצאות. לפיכך יש להימנע וריאציות כאלה. זה נצפה כי שחרור סידן גלוטמט קולט-תלוי המתרחש במהלך שלבי הכנה בלתי הפיך יכול להשפיע על סינתזת חלבון ברקמת עצבים 35,36, 37. שימוש slicers רקמות ידני יכול לעזור להקטין את זה כך שהוא מאפשר את התהליך להסתיים מהר מאוד בהשוואה לvibraslicers. עם זאת, מעבדות רבות גם להשתמש ביעילות vibraslicers עם אמצעי זהירות דרוש לשמירה על כדאיות פרוסה. גורם חשוב נוסף שיש לשקול הוא תקופת הדגירה הארוכה לפני תחילת הניסויים. זה כבר ציין להיות באמת חיוני להשגת יציבות ברמות מדינה והפעלת קינאז חילוף חומרים בפרוסות לאחר ההפרעה שנגרמה במהלך ההכנה 23. יציבות זו דרושה לעקביות בהקלטות לטווח ארוך. אנו מדגישים שוב, בתצפית זו ומציעים שעות דגירה הארוכות של שעות על 3.
מגוון רחב של פרמטרים גירוי ידוע לגרום LTP, אבל המנגנונים המולקולריים שהושרו בכל מקרה לא יכולים להיות אותו הדבר (לסקירה ראה 38). זה יכול להשפיע על העמידות ומאפיינים אחרים של LTP ש, בתורו, יכול להשפיע על התוצאות של ניסויי תיוג ולכידה הסינפטי. לכן חשוב כדי לאמת את פרדיגמות הגירוי ומאפייניםשל LTP שהושרו בתנאים של המעבדה ביצוע ולשמור על עקביות.
בדרך כלל אנחנו לא מחשיבים ניסויים עם מטחי סיבי presynaptic גדולים מאוד ועם fEPSPs המקסימאלי פחות מ -0.5 mV והניסויים הכוללים שינויים משמעותיים במטח הסיבים במהלך ההקלטות גם דחו. יתר על כן, בעת ביצוע ניסויים דו-מסלול או שלושה-מסלול, זה חשוב כדי להבטיח את עצמאות המסלול. זה יכול להתבצע עם פרוטוקול סיוע לזווג דופק 28.
חסרון אחד של מערכות הקלטת הממשק הוא ההיווצרות של טיפות התעבות על אלקטרודות בשעות ההקלטה הארוכות בשל הבדלי הטמפרטורה ולחות בין התא והסביבה. טיפות אלה צריכים להיות בזהירות מחקו מעת לעת. אחרת הטיפות יכולות לטפטף על הפרוסות ולגרום הפרעה או אפילו הפסד של אותות. אנחנו בדרך כלל להתמודד עם זה בy סופג מיומנות הטיפות מודרכות תחת מיקרוסקופ באמצעות פתיל נייר סינון דק, בלי לגעת באלקטרודות. עם זאת, הפתרון הטוב ביותר יהיה להשתמש במערכת הסקה מרכזית, כגון מערכת ETC שפותחה על ידי חוקרים מאוניברסיטת אדינבורו.
בנימה סיכום, מגוון של שיטות קיימים במעבדות ברחבי העולם, המשמשות להכנת פרוסות בהיפוקמפוס למטרות ניסויים שונות. כל אחד מההליך מציע כמה יתרונות על פני אחרים. אחד צריך לייעל זהירות פרטי הפרטים של הפרוטוקול כדי להתאים למטרת הניסוי. אנו מקווים שמאמר זה מסייע בשיפור היבטים מסוימים של המתודולוגיה ללימוד תהליכים מאוחרים אסוציאטיביים כגון STC ולכידה צולבת.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
Materials
| I. Dissection Tools | |||
| 1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
| B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
| 2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
| BC100R | |||
| 3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
| 4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
| B-Braun/Aesculap, Germany | |||
| BB73 | |||
| 5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
| 6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
| 7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
| 8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
| II. ACSF component chemicals | |||
| 1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| 4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| 5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| 6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| III. Electrophysiology Instruments | |||
| 1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
| 2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
| 3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
| 4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
| 5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
| 6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
| 7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
| 8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
| 9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
| 10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
| 11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
| 00-42-102-0000 (MM-32) | |||
| 12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |
References
- Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361, 31-39 (1993).
- Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. Learning-related synaptic plasticity: LTP and LTD.. Current Opinion in Neurobiology. 1, 113-120 (1991).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual review of neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: An Embarrassment of Riches. Neuron. 44, 5-21 (2004).
- Krug, M., Lossner, B., Ott, T. Anisomycin blocks the late phase of long-term potentiation in the dentate gyrus of freely moving rats. Brain research bulletin. 13, 39-42 (1984).
- Frey, U., Krug, M., Reymann, K. G., Matthies, H. Anisomycin blocks an inhibitor of protein synthesis, blocks late phases of LTP phenomena in the hippocampal CA1 region in vitro. Brain research. 452, 57-65 (1988).
- Otani, S., Marshall, C. J., Tate, W. P., Goddard, G. V., Abraham, W. C. Maintenance of long-term potentiation in rat dentate gyrus requires protein synthesis but not messenger RNA synthesis immediately post-tetanization. 神经科学. 28, 519-526 (1989).
- Frey, U., Frey, S., Schollmeier, F., Krug, M. Influence of actinomycin D, a RNA synthesis inhibitor, on long-term potentiation in rat hippocampal neurons in vivo and in vitro. The Journal of physiology. 490 (3), 703-711 (1996).
- Nguyen, P. V., Kandel, E. R. A macromolecular synthesis-dependent late phase of long-term potentiation requiring cAMP in the medial perforant pathway of rat hippocampal slices). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 3189-3198 (1996).
- Manahan-Vaughan, D., Kulla, A., Frey, J. U. Requirement of translation but not transcription for the maintenance of long-term depression in the CA1 region of freely moving rats. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 8572-8576 (2000).
- Frey, U., Morris, R. G. M. Synaptic tagging and long-term potentiation. Nature. 385, 533-536 (1997).
- Frey, U., Morris, R. G. Weak before strong: dissociating synaptic tagging and plasticity-factor accounts of late-LTP. Neuropharmacology. 37, 545-552 (1998).
- Redondo, R. L., Morris, R. G. Making memories last: the synaptic tagging and capture hypothesis. Nature reviews. Neuroscience. 12, 17-30 (2011).
- Martin, K. C., Kosik, K. S. Synaptic tagging — who’s it?. Nature reviews. Neuroscience. 3, 813-820 (2002).
- Frey, U., Morris, R. G. Synaptic tagging: implications for late maintenance of hippocampal long-term potentiation. Trends in neurosciences. 21, 181-188 (1998).
- Martin, K. C. Synaptic tagging during synapse-specific long-term facilitation of Aplysia sensory-motor neurons. Neurobiology of learning and memory. 78, 489-497 (2002).
- Shires, K. L., Da Silva, B. M., Hawthorne, J. P., Morris, R. G., Martin, S. J. Synaptic tagging and capture in the living rat. Nature communications. 3, (2012).
- Ramachandran, B., Frey, J. U. Interfering with the actin network and its effect on long-term potentiation and synaptic tagging in hippocampal CA1 neurons in slices in vitro. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12167-12173 (2009).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Identification of compartment- and process-specific molecules required for ‘synaptic tagging’ during long-term potentiation and long-term depression in hippocampal CA1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 5068-5080 (2007).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Sacktor, T. C., Frey, J. U. Synaptic tagging and cross-tagging: the role of protein kinase Mzeta in maintaining long-term potentiation but not long-term depression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 5750-5756 (2005).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic Tagging and Capture: Differential Role of Distinct Calcium/Calmodulin Kinases in Protein Synthesis-Dependent Long-Term Potentiation. The Journal of Neuroscience. 30, 4981-4989 (2010).
- Sajikumar, S., Frey, J. U. Late-associativity, synaptic tagging, and the role of dopamine during LTP and LTD. Neurobiology of learning and memory. 82, 12-25 (2004).
- Sajikumar, S., Navakkode, S., Frey, J. U. Protein synthesis-dependent long-term functional plasticity: methods and techniques. Current Opinion in Neurobiology. 15, 607-613 (2005).
- Villers, A., Ris, L. Improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
- Pohle, W., Reymann, K., Jork, R., Malisch, R. The influence of experimental conditions on the morphological preservation of hippocampal slices in vitro. Biomedica biochimica acta. 45, 1145-1152 (1985).
- Reymann, K. G., et al. The duration of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampal slice preparation. Brain research bulletin. 15, 249-255 (1985).
- Sajikumar, S., Korte, M. Different compartments of apical CA1 dendrites have different plasticity thresholds for expressing synaptic tagging and capture. Learning & Memory. 18, 327-331 (2011).
- Li, Q., et al. Making Synapses Strong: Metaplasticity Prolongs Associativity of Long-Term Memory by Switching Synaptic Tag Mechanisms. Cerebral Cortex. 24, 353-363 (2014).
- Sajikumar, S., Frey, J. U. Anisomycin inhibits the late maintenance of long-term depression in rat hippocampal slices in vitro. Neuroscience Letters. 338, 147-150 (2003).
- Ishikawa, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Diversity of neuropsin (KLK8)-dependent synaptic associativity in the hippocampal pyramidal neuron. The Journal of physiology. 589, 3559-3573 (2011).
- Ishikawa, Y., Horii, Y., Tamura, H., Shiosaka, S. Neuropsin (KLK8)-dependent and -independent synaptic tagging in the Schaffer-collateral pathway of mouse hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 843-849 (2008).
- Sajikumar, S., Morris, R. G. M., Korte, M. Competition between recently potentiated synaptic inputs reveals a winner-take-all phase of synaptic tagging and capture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 12217-12221 (2014).
- Navakkode, S., Sajikumar, S., Frey, J. U. The type IV-specific phosphodiesterase inhibitor rolipram and its effect on hippocampal long-term potentiation and synaptic tagging. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 7740-7744 (2004).
- Kohl, M. M., et al. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nature. 14, 1413-1415 (2011).
- Frey, U., Huang, Y. Y., Kandel, E. R. Effects of cAMP Simulate a Late Stage of LTP in Hippocampal CA1 Neurons. Science. 260, 1661-1664 (1993).
- Erdogdu, G., Uto, A., Hossmann, K. -. A. The effect of global ischemia and recirculation of rat brain on protein synthesis in vitro. Metab Brain Dis. 8, 199-206 (1993).
- Djuricic, B., Berger, R., Paschen, W. Protein synthesis and energy metabolism in hippocampal slices during extended (24 hours) recovery following different periods of ischemia. Metab Brain Dis. 9, 377-389 (1994).
- Park, P., et al. NMDA receptor-dependent long-term potentiation comprises a family of temporally overlapping forms of synaptic plasticity that are induced by different patterns of stimulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369, 20130131 (2014).
