Summary

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Published: April 08, 2015
doi:

Summary

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Abstract

共焦点顕微鏡は、骨髄のような複雑な組織内の複数の細胞型の局在の分析のために選択される方法である。多くの場合、それは、このように評価者に依存するバイアスを導入し者間信頼性を低下させる危険性を有する、手動カウントに依存しているしかし、細胞局在の分析及び定量化は困難である。また、細胞型は、それらの出現頻度に強く異なる場合は特に、ランダムな位置からの二つのセルの結果の間の共局在するかどうかを判断することはしばしば困難である。ここでは、骨髄中の細胞の共局在の公平な定量化するための方法が導入される。プロトコルは、骨髄を​​含む全マウスの長骨の組織学的切片を得るために使用される試料調製、ならびに染色プロトコルと高解像度画像の取得を記載している。造血細胞および非ヘマトの認識及ぶ分析のワークフローこれらの細胞間の直接的なコンタクトの定量に2次元(2D)骨髄画像におけるopoietic細胞型が提示される。これはまた、特定の細胞型を、周囲の細胞微小環境に関する情報を取得するために、近傍分析を含む。 2つの細胞型の共局在は、ランダムセル測位の単なる結果であるか、または細胞間の優先的な関連性を反映しているかどうかを評価するために、造血ならびに間質細胞の場合には、この仮説をテストするのに適したシミュレーションツールは、ある使用。このアプローチは、骨髄に限定されず、組織学的データの再現性のある、定量的な分析を可能にする他の組織にも拡張することができる。

Introduction

、光学イメージングを含む顕微鏡における近年の急速な技術開発、に、全組織のコンテキスト内の細胞の解析は、免疫学者のためにますますアクセス可能となっています。懸濁液中の単一細胞の特徴は、細胞および分子の機能を理解するための貴重な不可欠な方法を表す。しかし、それらの(マイクロ)-anatomical環境内の細胞の解析は、免疫応答の発生のような複雑なプロセスに協力種々の細胞型の間の相互作用を理解するために不可欠である。

顕微鏡研究は、画像から定性的な情報を取得することが比較的容易であるが、それは部分的にはこの分野での分析方法は、画像取得が可能であるものと比較して遅れているという事実のために、これらのデータを定量化するための課題である。多くの研究者は、まだ、時間がかかり、その組織学的画像におけるマニュアル細胞計数を頼るしたがって、異なる評価者の間でバイアスを導入し、他のグループによって複製を妨げる。多くの場合、1代表画像は、それがハード読者はこのようなイベントの統計的関連性を判断できるようにすること、出版物における細胞の位置や共局在に関する声明を下線に選択される。

一緒にされた画像データの完全な情報内容はほとんど利用されないという事実と、この組織学的画像を分析するためのより公平な、迅速かつ包括的アプローチの必要性を強調している。

骨髄は、大人の脊椎動物の造血器官として重要な生体機能にかかる複雑な組織である。造血細胞1,2-ための出生地であるとBリンパ球の発達3に重要な役割を果たしている他に、免疫反応は4を開始し、成熟した、循環B細胞5をサポートしているサイトとして作用する。私の維持に加えて、その役割免疫記憶を構成する細胞のいくつかの種類が存在6-9存在することが判明しているようにmmunologicalメモリは、ますます10年間で明らかになり、理解されている。

骨髄およびその機能の複雑な組織構造との関係は依然としてとらえどころのないままである。そのようなTおよびB細胞のゾーンとしてマクロ区画に編成されて二次リンパ器官とは異なり、骨髄をクリアマクロ区画を欠いている。これまでのところ、骨髄中の個別のコンパートメントは、骨皮質に、または血管系への近接によって定義されています。そのような幹細胞を支持するようなプロセスの数の骨髄中の様々な常駐間質細胞集団の重要性は、そのような長命形質細胞(パソコン)などの免疫記憶細胞集団(CD4 +のB細胞またはメンテナンスの開発およびCD8 +メモリーT細胞)は、明らかに、骨髄中の微小区画のある程度があることを示している。

<pクラスは= "jove_content">これらの観​​察は、骨髄中の(様々な段階での細胞の維持、B細胞の発達の幹、および免疫記憶の維持)特定の機能に特化して別個の微細解剖ニッチの概念をもたらした。異なる機能を果たすニッチ間の異質性のある程度があるように思われるが、そのようなCXCケモカインリガンド12(CXCL12)またはインターロイキン7(IL-7)、などの間質細胞によって産生される因子のいくつかはのための決定的な要素であるこれらのニッチ10のいくつか。骨髄間質細胞の可視化および特徴付けにより、細長い樹状骨髄全体ネットワークを形成する拡張機能、および間質亜集団を区別するための適切なマーカーの欠如との形態学的特徴のために困難である。

これらのニッチは、それらの細胞および分子は複合に対する共通の特徴を共有してどの程度としてはまだ明らかではないn、および要素は、特定のニッチが一意レンダリング。間質細胞に加えて、造血細胞型は、ニッチのいくつかについて、少なくとも特定の信号を提供することによって、重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、ニッチ組成の複雑さは、 その場でそれらの分析を必要とし、免疫学者や血液学者がその細胞成分間の空間的関係を分析することによって、例えば 、骨髄マイクロアーキテクチャにズームインすることがますます重要になってきた。

ここでは、自動化された公平な方法で、骨髄における細胞の共局在及び近隣関係を定量化するための戦略が提示されている。蛍光性の間質細胞及び非蛍光造血細胞を保有するキメラマウスの生成を含むワークフローの詳細、脱灰骨からの組織切片の調製、骨全体を覆って共焦点画像の取得、並びに携帯cは自動画像解析O-ローカライズおよびシミュレーションツールによってランダムポジショニングからの検証/差別が( 図8)が設けられている。

Protocol

動物実験は動物福祉(LandesamtエリーゼGesundheitウントSoziales、ベルリン)のための適切な状態委員会によって承認された、現在のガイドラインと規則(動物実験のライセンスG0194 / 11)に従って行った。 蛍光骨髄キメラマウスの1世代注:9の前に説明したように、骨髄間質細胞を可視化する蛍光骨髄キメラマウスの作製が行われる。 デル…

Representative Results

カワモトテープ法で脱灰骨の凍結切片を切断し骨幹ならびにそれらと骨端領域の両方で、まだ石灰化した骨に取り付けられた内膜領域の骨髄を、骨全体が完全な部分として切断することができ骨梁の高密度( 図1)。切片の核染色は、調製物中の小さな亀裂を完全に回避することはできないが、正弦波と動脈の構造ならびに実質の網状ネットワークがそのままとどまることがわか…

Discussion

現代の光学イメージング法の進歩にもかかわらず、組織学的データの分析は、依然として多くの場合、適切な定量化ツールおよび方法の欠如によって、または関心対象の小領域に集中偏った分析によって妨げられる。ここに提示相乗的なアプローチは、全体の骨髄領域を覆う画像解析を組み合わせた自動セグメンテーションおよび様々な造血細胞および間質細胞型、共局在化分析、新しいお?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは貴重な議論アンドレアスRadbruchに感謝。私たちは、優れた技術支援のための動物のケアとロバート·ギュンターの支援のためのザビーネGruczek、パトリックThiemannとマヌエラOhdeに感謝しています。私たちは、原稿の校正のための組織学サンプルの評価とランディリンドクイストのために私たちの訓練を受けた評価者ローラ·Oehme、Jannikeバヤット-Sarmadi、Karolinポロック、カトリン·ロス、フィレンツェPacheとカタリーナ·ホーンに感謝。私たちは、MBP特異的抗体のためのJ.とN·リー、メイヨークリニック、スコッツデール、アリゾナ州、米国に感謝します。

この作品は、生体顕微鏡用JIMI-DFG中核施設ネットワークグラントによって及びTRR130 / TP17により、DFG HA5354 / 4-1によってサポートされていました、そしてAEHSZに2165 FOR DFG(HA5354 / 6-1)は、国際マックス·プランクによってサポートされていました感染症や免疫(IMPRS-IDI)、ベルリンのための学校。

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate,  5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) Sigma P4333   Sigma     H3375   Sigma   www.sigmaaldrich.com
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin)
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100 www.rockland-inc.com
20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-Sucrose Carl Roth 4621.1 www.carlroth.com
Dry ice
Acetone Sigma.Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura  4557 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com
Tissue-Tek O.C.T. Sakura  4583  www.sakuraus.com
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP http://section-lab.jp/index.html
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP http://section-lab.jp/index.html
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP http://section-lab.jp/index.html
Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com
polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379 www.rockland-inc.com
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355 www.lifetechnologies.com
rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247 www.lifetechnologies.com
rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
rat anti-k light chain – FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA www.sigmaaldrich.com
Fluorescent mounting medium DAKO S3023 www.dako.com
Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2 www.carlroth.com
Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) VWR 48311-703 www.vwr.com
Laser scanning confocal microscope  equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de
VC2012 Runtime Microsoft free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org)  
Fiji image analysis software  free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

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Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

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