אוטומטי כימות של תא המטופואטיות - אינטראקציות תא סטרומה בתמונות היסטולוגית של עצם Undecalcified
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
מיקרוסקופיה Confocal היא שיטת בחירה של הניתוח של לוקליזציה של סוגי תאים מרובים בתוך רקמות מורכבות כמו מוח העצם. עם זאת, הניתוח והכימות של לוקליזציה סלולרית הוא קשה, כמו במקרים רבים הוא מסתמך על ספירה ידנית, ובכך נושא בסיכון של החדרת הטיה מדרג תלוי והפחתת אמינות interrater. יתר על כן, לעתים קרובות קשה לשפוט אם שיתוף הלוקליזציה בין שני תאי תוצאות ממיקום אקראי, במיוחד כאשר סוגי תאים שונים מאוד בתדירות הופעתם. כאן, שיטה לכימות משוחדת של שיתוף לוקליזציה סלולרית במח העצם הוא הציג. הפרוטוקול מתאר את הכנת המדגם ששמשה לסעיפים היסטולוגית של עצמות ארוכות עכבריות כל כוללים מח העצם, כמו גם את הפרוטוקול מכתים ורכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה. עבודה ניתוח פורש מההכרה בhematopoietic ולא hematסוגי תאי opoietic בתמונות מח 2 ממדי עצם (2D) לכימות של מגעים הישירים בין התאים אלה מוצגים. זה כולל גם ניתוח שכונה, כדי לקבל מידע על מייקרו-הסביבה הסלולרית המקיפה סוג תא מסוים. על מנת להעריך האם שיתוף לוקליזציה של שני סוגי תאים היא התוצאה בלבד של מיצוב תא אקראי או משקפת עמותות מועדפים בין התאים, כלי סימולציה אשר מתאים לבדיקת השערה זו במקרה של היווצרות הדם, כמו גם תאי סטרומה, הוא בשימוש. גישה זו אינה מוגבלת למוח העצם, וניתן להרחיב לרקמות אחרות, כדי לאפשר ניתוח לשחזור, כמותי של נתונים היסטולוגית.
Introduction
בשל ההתפתחויות האחרונות טכנולוגיות מהירות במיקרוסקופ, כוללים הדמיה אופטית, הניתוח של תאים בהקשר של כל הרקמה הפך לנגיש יותר ויותר לאימונולוגים. האפיון של תאים בודדים בהשעיה מייצג שיטת ערך והחיונית להבנת תפקוד תאי ומולקולרי. עם זאת, הניתוח של התאים בתוך סביבת -anatomical (מיקרו) שלהם הוא חיוני להבנת יחסי הגומלין בין סוגי תאים שונים המשתפים פעולה בתהליכים מורכבים כגון הפיתוח של מערכת חיסונית.
אמנם קל יחסית לmicroscopists להשיג מידע איכותי מתמונות, זה עדיין מהווה אתגר לכמת נתונים אלה, בין ההיתר בשל העובדה ששיטות ניתוח בתחום זה מפגרות מאחור בהשוואה למה שאפשרי ברכישת תמונה. חוקרים רבים עדיין מסתמכים על ספירת תאים ידנית בתמונות היסטולוגיה זמן רב,כך מציג הטיה בין מדרגים שונים ופוגע שכפול על ידי קבוצות אחרות. לעתים קרובות, תמונה אחת נציג נבחרה כדי להדגיש הצהרה על עמדה סלולרית או שיתוף לוקליזציה בפרסום, מה שהופך את זה קשה לקורא לשפוט את הרלוונטיות הסטטיסטיות של אירוע כזה.
יחד עם העובדה שתוכן המידע המלא של נתוני תמונה מנוצל לעתים רחוקות, זה מדגיש את הצורך בגישה יותר משוחדת, מהר יותר ומקיפה לנתח תמונות היסטולוגית.
מח העצם הוא רקמה מורכבת, אשר לוקחת על פונקציות חיוניות חשובות כמו האיבר של hematopoiesis בבעלי חוליות מבוגרות. מלבד היותו מקום הולדתו לתאי hematopoietic 1,2 ולשחק תפקיד חשוב בהתפתחות B לימפוציטים 3, היא פועלת גם כאתר שבו תגובה חיסונית הם יזמו 4 ותומך, הסירקולציה המחודשת תאי B בוגרים 5. בנוסף, תפקידה בשמירת iזיכרון mmunological הפך ממוערך יותר ויותר בעשור האחרון, כמספר סוגים של תאים המהווים זיכרון חיסוני נמצאו מתגוררים בי 6-9.
בין הארכיטקטורה המורכבת הרקמה של מוח העצם ואת תפקידיו ביחס עדיין להישאר חמקמק. שלא כמו איברי הלימפה משניים, אשר מאורגנים במקרו-תאים כגון אזורי תא T ו- B, מח העצם חסר מאקרו-מידור ברור. עד כה תאים שונים במוח עצם מוגדרים על ידי קרבתם לקליפת מוח העצם או לכלי דם. החשיבות של אוכלוסיות תאי סטרומה תושב השונות במוח העצם עבור מספר התהליכים כגון תאי גזע תמיכה, פיתוח של תאי B או תחזוקה של אוכלוסיות תאי זיכרון חיסוניים (כגון תאי פלזמה חיים ארוכים (מחשבים), CD4 + ו CD8 + תאי T הזיכרון) עולה בבירור כי יש מידה מסוימת של מיקרו-מידור במח העצם.
<pclass = "jove_content"> תצפיות אלה הובילו לרעיון של נישות microanatomical שונות, אשר מתמחים בפונקציות מסוימות (גזע תחזוקת תא, פיתוח תאי B בשלבים שונים, ותחזוקה של זיכרון חיסוני) במח העצם. למרות שנראה שיש מידה מסוימת של הטרוגניות בין הנישות המשרתות פונקציות שונות, חלק מהגורמים המיוצרים על ידי תאי סטרומה, כגון יגנד CXC-chemokine 12 (CXCL12) או interleukin 7 (IL-7), הם מרכיבים חיוניים ל כמה נישות אלה 10. ההדמיה והאפיון של תאי סטרומה במח העצם קשה בשל תכונות המורפולוגיות שלהם עם סיומות ארוכות, דקות דנדריטים יצירת רשת בכל רחבי מוח העצם, וחוסר הסמנים מתאימים להפלות תת-אוכלוסיות סטרומה.זה עדיין לא ברור באיזו מידת הנישות הללו חולקות תכונות משותפות ביחס לCompositio התאי והמולקולרי שלהםn, ובו אלמנטים להפוך נישה מסוימת ייחודית. בנוסף לתאי סטרומה, סוגי hematopoietic תא הוכחו לשחק תפקיד מכריע במתן אותות מסוימים לפחות לחלק מהנישות. ברור, את המורכבות של הרכב הנישה דורשת הניתוח שלהם באתר, וזה הפך להיות חשוב יותר ויותר עבור אימונולוגים והמטולוגים כדי להתמקד על מייקרו-ארכיטקטורת מח עצם, למשל, על ידי ניתוח היחסים מרחביים בין המרכיבים התאיים שלה.
כאן, אסטרטגיה לכמת יחסי שיתוף לוקליזציה ושכונה סלולריים במח העצם בצורה אוטומטית ובלתי משוחדת מוצגת. עבודה מפורטת הכולל את הדור של עכברי chimeric, חסת תאי ניאון סטרומה ותאי hematopoietic לא פלורסנט, הכנת סעיפים היסטולוגית מעצמות undecalcified, רכישה של תמונות confocal מכסים את כל העצם, כמו גם ניתוח התמונה האוטומטית של ג הסלולריo-לוקליזציה והאימות / אפליתה ממיקום האקראי על ידי כלי סימולציה מסופקת (איור 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות ההתקדמות בשיטות הדמיה אופטיות מודרניות, הניתוח של נתונים היסטולוגית עדיין לעתים קרובות הפריע חוסר הכלים המתאימים כימות ושיטות, או על ידי ניתוח מוטה המתמקדים באזור קטן של עניין. הגישה סינרגיסטי מוצגת כאן משלבת ניתוח תמונה המכסה את האזור כולו מח עצם, פילוח אוטומ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אנדריאס רדברוך לדיונים חשובים. אנו מודים לסבין Gruczek, פטריק טימן והמנואלה Ohde לקבלת סיוע בטיפול בבעלי החיים ורוברט גינטר לקבלת סיוע טכני מעולה. אנו מודים המדרגים המיומנים שלנו לורה Oehme, Jannike ביאת-Sarmadi, Karolin Pollok, קתרין רוט, פירנצה Pache וקתרינה הורן להערכת דגימות היסטולוגיה ורנדי Lindquist להגהה של כתב היד. אנו מודים ג 'ונ' לי, Mayo Clinic, סקוטסדייל, אריזונה, ארצות הברית לנוגדני MBP הספציפיים.
עבודה זו נתמכה על ידי DFG HA5354 / 4-1, על ידי ג'ימי-מענק רשת מתקן גרעין DFG למיקרוסקופיה intravital ועל ידי TRR130 / TP17, וDFG ל2,165 (HA5354 / 6-1) לAEHSZ נתמכה על ידי הבינלאומי מקס פלנק בית הספר למחלות זיהומיות ואימונולוגיה (IMPRS-IDI), ברלין.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
