الكمي الآلي للخلية المكونة للدم - التفاعلات خلية انسجة في صور النسيجية من Undecalcified العظام
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
المجهر متحد البؤر هو الأسلوب المفضل لتحليل توطين أنواع الخلايا متعددة داخل أنسجة معقدة مثل نخاع العظام. ومع ذلك، فإن التحليل النوعي والكمي لتوطين الخلوية أمر صعب، لأنها تعتمد في كثير من الحالات على العد والفرز اليدوي، وبالتالي تحمل مخاطر إدخال تحيز تعتمد على التصنيفات والحد من الموثوقية interrater. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يكون من الصعب الحكم على ما إذا كان في توطين التعاون بين خليتين النتائج من المواقع عشوائي، وخصوصا عندما تختلف أنواع الخلايا بقوة في وتيرة حدوثها. هنا، هو عرض طريقة لتقدير غير متحيز للخلوي شارك في التعريب في نخاع العظام. يصف بروتوكول إعداد العينة المستخدمة للحصول على أقسام النسيجية من بأكملها العظام الطويلة الفئران بما في نخاع العظام، وكذلك بروتوكول تلطيخ واكتساب صور عالية الدقة. سير عمل تحليل تمتد من الاعتراف المكونة للدم وغير همت-يتم تقديم أنواع الخلايا opoietic في 2 الأبعاد صور نخاع (2D) العظم لالكمي لاتصالات مباشرة بين تلك الخلايا. وهذا يشمل أيضا تحليلا الحي، للحصول على معلومات حول المكروية الخلوية المحيطة نوع من الخلايا معين. من أجل تقييم ما إذا كان المشارك توطين أنواع الخلايا اثنين هو مجرد نتيجة لتحديد المواقع خلية عشوائي أو يعكس الجمعيات التفضيلية بين الخلايا، وهي أداة المحاكاة الذي هو مناسبة لاختبار هذه الفرضية في حالة المكونة للدم وكذلك خلايا انسجة، هو المستخدمة. وهذا النهج لا يقتصر على نخاع العظام، ويمكن أن تمتد إلى الأنسجة الأخرى للسماح للتكرار، والتحليل الكمي للبيانات النسيجية.
Introduction
بسبب التطورات التكنولوجية السريعة التي حدثت مؤخرا في المجهر، بما في ذلك التصوير الضوئي، أصبح تحليل الخلايا داخل سياق الأنسجة كلها يمكن الوصول إليها على نحو متزايد لالمناعة. توصيف الخلايا واحد في تعليق يمثل طريقة قيمة والتي لا غنى عنها لفهم وظيفة الخلوية والجزيئية. ومع ذلك، فإن تحليل الخلايا داخل (الصغرى) بيئتهم -anatomical أمر ضروري لفهم التفاعلات بين مختلف أنواع الخلايا التي تتعاون في العمليات المعقدة مثل تطوير الاستجابات المناعية.
في حين أنه من السهل نسبيا على المجاهر للحصول على المعلومات النوعية من الصور، فإنه لا يزال يشكل تحديا لقياس هذه البيانات، ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن طرق التحليل في هذا المجال لا تزال متخلفة بالمقارنة مع ما هو ممكن في الحصول على الصور. لا يزال كثير من الباحثين يعتمدون على العد اليدوي خلية في الصور الأنسجة التي تستغرق وقتا طويلا،وبالتالي إدخال التحيز بين المقيمون المختلفة والتي تعيق التكرار من قبل جماعات أخرى. في كثير من الأحيان، يتم اختيار صورة تمثيلية واحدة للتأكيد بيان على موقف الخلوي أو زملاء التعريب في منشور، مما يجعل من الصعب على القارئ للحكم على أهمية الإحصائية لمثل هذا الحدث.
جنبا إلى جنب مع حقيقة أن محتوى المعلومات كاملة من بيانات الصورة ونادرا ما تستغل، وهذا يؤكد على الحاجة إلى نهج أكثر متحيز وأسرع وشامل لتحليل الصور النسيجية.
نخاع العظم هو نسيج المعقدة، والتي تأخذ على الوظائف الحيوية الهامة بوصفها جهاز تكون الدم في الفقاريات الكبار. وبالإضافة إلى كونها مهد للخلايا المكونة للدم 1،2 ولعب دورا هاما في التنمية اللمفاويات B 3، فإنه يعمل أيضا كموقع حيث بدأت التفاعلات المناعية 4 ويدعم، وخلايا إعادة تدوير B الناضجة 5. وبالإضافة إلى ذلك، ودورها في الحفاظ على طأصبح ذاكرة mmunological تقدير متزايد في العقد الماضي، حيث تم العثور على عدة أنواع من الخلايا التي تشكل ذاكرة مناعية في الإقامة هناك 6-9.
العلاقة بين العمارة الأنسجة المعقدة للنخاع العظام وظائفها لا تزال بعيدة المنال. على عكس الأجهزة اللمفاوية الثانوية، التي يتم تنظيمها في مقصورات الكلية مثل مناطق خلية T و B، ونخاع العظام يفتقر إلى اضحة التقسيم الكلي. وحتى الآن تم تعريفها مقصورات متميزة في نخاع العظام بواسطة قربها من قشرة العظام أو الأوعية الدموية. أهمية مختلف السكان الخلية انسجة المقيمين في نخاع العظام لعدد من العمليات مثل دعم الخلايا الجذعية، وتطوير الخلايا البائية أو صيانة السكان خلية ذاكرة المناعة (مثل خلايا البلازما المعمرة (أجهزة الكمبيوتر)، CD4 + و CD8 + خلايا الذاكرة T) يشير بوضوح إلى أن هناك درجة معينة من التقسيم الجزئي في نخاع العظام.
<pالطبقة = "jove_content"> وقد أدت هذه الملاحظات إلى مفهوم محاريب microanatomical متميزة، وهي متخصصة في بعض وظائف (الجذعية صيانة الخلية، وتطوير الخلايا B في مراحل مختلفة، والحفاظ على الذاكرة المناعية) في نخاع العظام. على الرغم من أن يبدو أن هناك درجة معينة من عدم التجانس بين المنافذ التي تخدم وظائف مختلفة، وبعض من العوامل التي تنتجها الخلايا اللحمية، مثل CXC-chemokine يجند 12 (CXCL12) أو انترلوكين 7 (IL-7)، هي العناصر الحاسمة ل العديد من هذه محاريب 10. التصور وتوصيف الخلايا اللحمية في نخاع العظام أمر صعب نظرا لخصائصها المورفولوجية مع طويلة، ملحقات شجيري رقيقة تشكيل شبكة في جميع أنحاء نخاع العظام، وعدم وجود علامات المناسبة لتميز القطعان اللحمية.وليس من الواضح لبعد ما مدى تتقاسم هذه المنافذ السمات المشتركة فيما يتعلق تكوين. من الخلوية والجزيئيةن، والتي تجعل عناصر مكانة معينة فريدة من نوعها. بالإضافة إلى خلايا انسجة، وقد ثبت أن أنواع الخلايا المكونة للدم للعب دورا حاسما من خلال توفير إشارات معينة على الأقل لبعض المنافذ. ومن الواضح أن تعقيد التركيبة المتخصصة يتطلب تحليلهم في الموقع، وأنها أصبحت ذات أهمية متزايدة للالمناعة وأمراض الدم لزوم في نخاع العظام المعمارية المصغرة، على سبيل المثال، من خلال تحليل العلاقات المكانية بين المكونات الخلوية لها.
هنا، ووضع استراتيجية لقياس شارك في توطين وحي علاقات الخلوية في نخاع العظام في طريقة تلقائية وغير متحيزة وتقدم. سير عمل مفصلة بما في ذلك جيل من الفئران خيالية، بإيواء الخلايا الفلورسنت انسجة والخلايا المكونة للدم غير الفلورسنت، وإعداد أقسام النسيجية من عظام undecalcified، والحصول على الصور مبائر تغطي العظم كله، فضلا عن تحليل الصور الآلي للج الخلويةوتقدم س التعريب ولها التحقق من صحة / التمييز من المواقع عشوائي من قبل أداة المحاكاة (الشكل 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من التقدم في أساليب التصوير البصرية الحديثة، لا يزال كثير من الأحيان أعاق تحليل البيانات النسيجي بسبب عدم وجود أدوات القياس الكمي المناسبة والأساليب، أو عن طريق التحليلات المغرضة التي تركز على منطقة صغيرة من الفائدة. نهج التآزر المقدمة هنا يجمع بين تحليل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أندرياس Radbruch لإجراء مناقشات قيمة. ونحن ممتنون لسابين Gruczek، باتريك تيمان ومانويلا Ohde للمساعدة في رعاية الحيوان وروبرت غونتر للحصول على مساعدة فنية ممتازة. نشكر المقيمون لدينا مدربين لورا Oehme، Jannike بيات-سرمدي، كارولين بولوك، كاترين روث، فلورنسا Pache وكاتارينا القرن لتقييم عينات الأنسجة وراندي ليندكويست لتصحيح التجارب المطبعية للمخطوطة. نشكر J. وN. لي، مايو كلينيك، سكوتسديل بولاية أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية عن الأجسام المضادة MBP محددة.
وأيد هذا العمل من قبل DFG HA5354 / 4-1، قبل JIMI-منحة الشبكة منشأة DFG الأساسية لintravital المجهري وTRR130 / TP17، وDFG FOR 2165 (HA5354 / 6-1) لAEHSZ كان مدعوما من ماكس بلانك الدولية مدرسة للأمراض المعدية والمناعة (IMPRS-IDI)، برلين.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
References
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
