Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
Воспалительная реакция с болезнью или травмой в центральной нервной системе (ЦНС) мало изучен, особенно в отношении взаимодействия между иммунной и резидентных клеток в ткани. Исследования этих клеточных взаимодействий в спинном мозге, представляют особый интерес в живом. Только легко доступны ЦНС белого вещества тракта в спинной столбцов спинного мозга, что делает этот важный участок, на котором сосредоточить усилия на улучшении посильную экспериментальный подход. Эти исследования были ограничены из-за технических трудностей в получении доступа и стабилизации ЦНС для работы с изображениями. Живая съемка в спинном мозге была описана ранее 1-13, однако, несколько исследований, обратившихся сотовой движение в травме спинного мозга за несколько часов после первоначального оскорбление. Травматический спинного поражение шнур сложная среда, с нейронами, астроциты, фибробласты, клетки-предшественники NG2 и иммунных клеток вкнг микроглии, нейтрофилы, макрофаги, Т-лимфоциты, В-лимфоциты и дендритные клетки 14,15. Макрофаги являются подмножеством иммунных клеток, ответственных за фагоцитоза в поражении, проникают из кровотока. Роль этих фагоцитов был обсужден с сообщениями о том, что эти клетки могут принимать как повреждения и защитных ролей в поврежденной ткани. Эти роли варьируются от увеличения среднего аксонов отмирание после травмы и действуя в фагоцитарной образом 16-22, к принятию на заживления раны фенотип и снижение функциональных дефицитов в раненное животное 21,23,24.
Ранее попытки выделить макрофаги микроглии, полагались в основном на морфологии здоровой ткани. Однако, активированные микроглии и макрофаги выразить многие из тех же маркеров и отобразить неотличимый морфологию после травмы 25-29, что делает разделение различных действий этих клеток трудно изучить BASред на только 30 этих факторов. Эти клетки могут быть отделены с помощью дифференциальной экспрессии CD45 методом проточной цитометрии 33,34, хотя этот подход менее полезны при выделении этих типов клеток в живом организме. Используя дифференциальное выражение CCR2 и CX3CR1 в микроглии и макрофагов, также были исследованы, хотя динамические изменения в экспрессии этих маркеров как моноциты дифференцируются в макрофаги могут осложнить точный анализ 35,36. Микроглия являются иммунные клетки-резиденты в ЦНС и воскресни из желточного мешка предшественников в период внутриутробного развития, в то время как макрофаги являются производными от прародителей костного мозга и войти в поврежденную ЦНС после инсульта 31,32. Альтернативный подход к использованию морфологию различать эти два типа клеток заключается в замене костный мозг с клеток-предшественников из животного-донора выражения прослеживается маркер в макрофагах, полученных от донора клеток-предшественников, сохраняя при этом житель ЦНС, Recipнике, полученных микроглии. Эти костного мозга химерные модели, как правило, используются во многих других применений 37-40. Этот метод имеет уникальные оговорки, связанные с повреждением целостности гематоэнцефалического барьера, вызванного облучением или цитотоксических лекарственных средств, используемых для ликвидации предшественников костного мозга в организме хозяина, тем самым ограничивая его использование в некоторых приложениях. Недавно, функциональные различия между микроглии и макрофагов в ЦНС начинают различить с помощью проточной цитометрии, чип-ген анализ массива и методы химеризм 24,26,41-44, которые окажутся очень полезными в будущем. Хотя разделения этих двух типов клеток остается сложной, понять их уникальные функции играет важную роль в приводя к более целенаправленной лечения расстройств, включающих как микроглии и макрофагов в ЦНС.
Описание клеточных взаимодействий в спинном поражении мозга имеет, прежде всего, исходить от исследований с участием моделей клеточных культур. Это dвследствии проблем, связанных с изображениями как спинного поражения мозга и клеток иммунной системы вместе в живом. Современные модели грызунов травмы спинного мозга различной формы и тяжести включают в себя модели ушиб 45,46, укола травм 2, рваная рана 47, а спинной колонка раздавить травм, описанную здесь, 16,18,48. Воспаление в мозговые оболочки увеличивается с тяжестью травмы и создает уникальные проблемы для имплантации окон или операций для серийного изображений. Некоторые из этих проблем включают инфильтрацию фагоцитирующих клеток, а также генерацию фиброзной ткани над хирургического вмешательства. Некоторые из этих вопросов могут быть преодолены путем создания небольших повреждений и покрытие подвергается спинного мозга с неиммуногенной перевязочный между твердой мозговой оболочкой и paraspinous мышц позволит в дальнейшем повторное открытие хирургии, как это делается здесь, чтобы учиться спинной колонки размозжение , Возможность изображением, только спинной части спинааль шнура также ограничивает выбор травмы, так как модели ушиб главным привести к повреждению центральной мозга, часто избавляя наиболее дорсальной части колонн спинных, особенно на ранних временных точках после травмы 45,49. Таким образом, мы описываем простую модель повреждения, который дает чистый, воспроизводимое, прямоугольной формы повреждение, которое полезно как для наблюдения за движением клеток внутри поражения, а также для облегчения количественной оценки аксонов положении по отношению к поражения.
Визуализации взаимодействия различных типов клеток в их нативной ткани отсеков в течение последующего патологии в реальном времени вызвало большой интерес. В густой сетью ЦНС, межклеточных контактов и сигнализации с соседними клетками имеют важное значение для нормальной функции и для понимания патологии ЦНС. Здесь мы описали использование 2-фотонной лазерной сканирующей микроскопии для наблюдения сотовой движения в механической поражения в спинном мозге. В дополнение к качеству хирургии и тканевой подготовки, механическая стабильность ткани имеет первостепенное значение для успешного покадровой микроскопии, в частности, выделения спинного мозга от дыхания артефакт движения. Стабильность может быть оценена путем поиска движения спинного мозга при вскрытии микроскопом, что соответствует скорости сердечных сокращений или дыхания животного. Стабильность должна быть оценена как во время выполнения операции, а также непосредственно перед началом изображений. Если анимыл не является стабильным, корректировки должны быть сделаны к размещению и герметичности спинного зажимов мозга. Cell-модели Тип конкретные флуоресцентные репортер мыши в сочетании с костного мозга химеры подходов позволило идентифицировать моноцитов по сравнению с микроглии и аксонов. Предыдущие исследования показали, что в крови моноцитов и не микроглии отвечают за среднее повреждением аксонов после травмы, используя методику, описанную здесь 43. Декстран конъюгированных краситель судно позволяет идентифицировать судно как обеспечить ориентиры и определить нарушения в целостности сосудов. Выбор подходящего люминесцентной модели репортер мыши имеет решающее значение для обеспечения надлежащей идентификации желаемых типов клеток, которые будут отображены.
Разработка люминесцентных мышиных моделях, которые подходят для исследований, проводимых также имеет важное значение для успеха эксперимента. Различие между этими двумя фагоцитирующих населения CX3CR1 + / GFP </sup> Клеток в ЦНС традиционно трудным. Как показано здесь, общий иммунологический метод, облучение химеры, могут быть использованы, чтобы отличить переключатель устойчивостью, CNS-резидента микроглии мозга от макрофагов, полученных костей. Процедуру облучения имеет потенциал, чтобы повредить гематоэнцефалический барьер и изменить клеток фенотипы, следовательно, использование этой модели следует рассматривать с осторожностью. Степень этих изменений отличается дозы облучения, а также длительность периода восстановления, и их влияние на различные воспалительные моделей не была полностью изучена. Эффекты облучения на ЦНС гематоэнцефалического барьера может быть сведено к минимуму путем защиты головы во время облучения, а это, как было показано, чтобы уменьшить проникновение клеток в спинном мозге после облучения, даже если спинной мозг не напрямую экранированный 52. Здесь мы обнаружили, что число клеток, проникающих в ЦНС в стационарном состоянии в результате химера поколения незначительно в отличие от Numbэ клеток, входящих поражения. Другие альтернативные модели, которые следует рассмотреть лекарственно-индуцированных химеры 52 или парабиотического модели мыши 53.
Здесь мы представили конкретный, простой и воспроизводимый небольшой модели повреждения, что приводит к поражению в белом веществе спинного спинного мозга, который легко изображения, используя 2-фотонной микроскопии. Этот способ также обеспечивает количественной оценке поражения для анализа степень аксонального отмирание в столбцах спинных, что в литературе был в сочетании с дополнительной фиксированной ткани анализа 16,18,43,48,54. В этой модели, животные отображать только минимальные дефицит и не требуют особого ухода после травмы. Будущие исследования с использованием спинной методы травмы колонка давка и визуализации, описанные здесь, могут быть мощными инструментами скрининга для оценки эффективности лечения травм спинного мозга. Эти процедуры могут включать в себя низкомолекулярные ингибиторы, наркотики, мобильные продукты, ткани трансплантатов и комбинаторные лечениес. Взаимодействие между макрофагов, микроглии и нейронов также могут играть определенную роль в других моделей заболеваний спинного мозга, включая рассеянный склероз, опухоли, менингит и боковой амиотрофический склероз, и этот метод может быть полезен при исследовании этих заболеваний, а также ,
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |