ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

הערה: יש שוכנו כל בעלי החיים ומנוצלים בהתאם לועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש (IACUC) במוסד. כל הנהלים שתוארו כאן אושרו על ידי Case Western Reserve University IACUC. 1. בעלי חיים מהונדסים השתמש בעכברי כתב ניאון זמינים מסחרי לתייג אקסונים (Thy-1 YFP H) 50 ומיקרוגליה / מונוציטים (CX3CR1 GFP / GFP 51; ראה רשימה של חומרים). יש intercrossed עכברים אלו ומתוחזק כמושבות רבייה פרט בהתאם למדיניות טיפול בבעלי החיים מוסדית. 2. מח עצם מפלצות לזהות בעלי חיים, כי הם לפחות 8 שבועות של גיל לשימוש כחיות נמען. הנח חיות מארח בכלוב הקרנה מחזיקה עגול שנועד להחזיק את העכבר בעמדה כדי להבטיח אפילו, הקרנה כל גוף. כוון את הטיימר על צסיום (Cs-137) irradiator לנהל dos קרינה של הגוף כולוגיל 800-1,000 Rads לבעלי החיים על פי הוראות יצרן (דוגמאות שהובאו כאן הוא 980 Rads). חזור חיות בכלובים שלהם לנוח למשך תקופה מינימאלית של 4 שעות. בחר בעלי חיים תורם של גנוטיפ המתאים (ראה איור 2 א) כמקור לתאי אב במח. הערה: התורמים המתאימים הם בעלי חיים המבטאים כתבי ניאון שושלת ספציפית שונים מהמארח לזהות אוכלוסיות תאים שונות, או אחד מאותו גנוטיפ כפקדים. מלא צלחת פטרי אחת עם אלכוהול 70%, ומנה שנייה עם 10 מיליליטר Roswell Park זיכרון המכון (RPMI) תקשורת ומסננת 40 מיקרומטר תא ספוגים בתקשורת. מלא צינור חרוטי 15 מיליליטר עם תקשורת RPMI. שמור את הכלים וצינור על קרח. להקריב בעלי החיים תורם על ידי CO 2 מחנק פי הנחיות מוסדיות. נקה את העור ופרווה על ידי השריית כל החיה עם אתנול 70% עד שכל הפרווה רטובה. הסר את skמהמחצית תחתונה של בעלי חיים על ידי חיתוך סביב אמצע הקטע ומושך את עור מעל הרגליים האחוריות כדי לחשוף באופן מלא את שרירי רגליים. הסר את עצם השוק על ידי overextension הקדמי במפרק הברך לעקור את העצם, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים סטרילית ומספריים, קליפה וחותך את השרירים משני הקצוות של עצם השוק. מניחים את העצמות בצלחת פטרי עם אלכוהול עד 30 שניות ולאחר מכן להעביר למסננת התא בתוך צלחת פטרי המכילה את התקשורת. לנקוע את מפרק הירך ולקלף את השרירים מחוברים לעצם הירך, הניח את עצם ירך קצרה באלכוהול ולאחר מכן למקם אותו באותה מסננת תא בתוך הצלחת. בשכונת תרביות רקמה, להשתמש במספרי סטרילי לחתוך את שני הקצוות של העצמות ולהכניס מחט 21 מד על מזרק 1 מיליליטר לסוף העצם. לשטוף את מוח לחרוטי 15 מיליליטר עם תקשורת. חזור על הנהלים לעצמות שנותרו. שימוש בחלק האחורי של הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר, עצם התאהבות מסתיים בתאמסננת על צלחת פטרי כדי לחלץ יותר תאים. הנח את המסנן על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהעביר את התקשורת עם תאים להישאף מצינור חרוטי 15 מיליליטר. השתמש בחלק האחורי של הבוכנה לרסק את מוח על מנת לקבל השעיה תא בודדת. שטוף את צינור חרוטי 15 מיליליטר, שברי עצמות ומסננת התא עם 30 מיליליטר של תקשורת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה התאים למשך 5 דקות ב XG 500 עד גלולה תאים. תאי דם אדום Lyse עם 2 מיליליטר של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) תמוגה חיץ במשך 2 דקות. להרוות את מאגר תמוגה עם 10 מיליליטר של תקשורת המכילה 10% בסרום שור עוברי. צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5-10 דקות עד גלולה. לשטוף את תאי פעם אחת ב 10 מיליליטר של תקשורת RPMI ופעמים במלח, צנטריפוגה XG ב 500 למשך 5-10 דקות עד גלולה לכל שטיפה. Resuspend תאים לריכוז סופי של 3 x 10 6 תאים ב200 μl של תמיסת מלח. העברה 3 x 10 6 תאי מח באמצעות הזרקה לוריד זנב לIRRעכברי נמען adiated. הנח מים acidified (pH 3.0) בכלוב נמען ולאפשר עכברים להתאושש. הערה: עכברים שאינם ההשתלה תמותי תוך 10-14 ימים לאחר ההליך. לאחר 8 שבועות, לאמת הכינון מחדש מח על ידי בחינת תאי מערכת חיסון בדם היקפי באמצעות cytometry זרימה (איור 2 ב-ג). פגיעה Crush טור 3. הגבי הערה: בחר בעלי חיים הכימרה מתאימים או בעלי חיים מהונדסים כפולים לניתוח המבוסס על הניסוי הרצוי. בעלי חיים בתאי מח עצם נגזר תושב או או שכותרתו נוצרו בשלבים קודמים. הכן וחיטוי כלים כירורגיים, כולל rongeurs, מלקחיים דומון # 4, איריס מספריים, מלקחיים לרקמות מחזיקות, מחט נהגים וקליפים פצע. הכן תרופות לניהול לעכברים לשליטה בכאב. Bupernex וMarcaine משמשים בדרך כלל לשליטה בכאב. השתמש בתרופות מתאימות כנדרשnd אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC). לגרום להרדמה עם isoflurane 4% ולשמור על עם 1-2% isoflurane כדי להשיג קצב נשימה של 60-100 נשימות לדקה. החל סיכה עין בעיניו של בעל החיים כדי למנוע יובש בהרדמה ולאשר חוסר התגובה על ידי צביטה ברגל. לשמור על הטמפרטורה באמצעות כרית חימום ולנטר את הטמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית. לגלח את הגב של העכבר עם מכונת גילוח חשמלי מעל רמת חוט השדרה ממוקדת, ולאחר מכן לשטוף את האזור שלוש פעמים עם povidone- יוד ואחריו אלכוהול פעמיים עם 70%. מניחים את החיה על וילון סטרילי, ולכסות את החיה עם עוד וילון סטרילי עם חור לחתוך במיקום מתאים כדי להמחיש את האתר כירורגית. לשמור את כל הכלים על סדינים מעוקרים לאורך כל הניתוח. חותך את העור לאורך קו האמצע ברמת עמוד השדרה הרצויה עם איריס מספריים כדי לחשוף את השרירים בגבו של בעל החיים. תחת dissecting מיקרוסקופ, לחתוך את שרירי גב, ובכלל זה הטרפז והרצועות של dorsi latissimus לאורך קו האמצע שבו הם מייחסים לתהליכי השדרה הגבי, ולחשוף את עמוד השדרה. הסירו את שרירי הכתף בין תהליכי הגב ורוחביים של החוליה כדי לחשוף את lamina של החוליה הספציפית שיש להסירו (T11 במקרה זה). לזהות T11 על ידי ההחדרה של הצלעות שאינן צפות האחרונות על התהליך הזה. הכנס טיפים של rongeurs לתוך החלל מעל ומתחת לתהליך שיש להסירו ולהרים מעט כדי לוודא שהם נמצאים באופן מאובטח במקום סביב lamina השדרה אך לא עמוקים מדי כדי לפגוע בעמוד השדרה. rongeurs לסגור בתנועה אחת כדי להסיר את lamina. הגדלת laminectomy כנדרש על ידי השימוש בrongeurs להסיר חלקים קטנים של החוליה שנותרה. מדוד 1 מ"מ מקצות # 4 מלקחיים על ידי מחזיק אותם נגד שליט וסימון עם סמן קבע. מדוד 1 מ"מ בהימור הפרדהWeen שתי שיניים על ידי מחזיק את המלקחיים נגד השליט ולתקן את הרוחב המרבי של הטיפים ל1 מ"מ על-ידי החלקת טבעת גומי מלקחיים למקום על המוט של המלקחיים. ליצור חור קטן על ידי החדרת מחט 30 מד דרך הדורה בנקודות הכניסה לשתי השיניים של המלקחיים כדי לגשת לחוט השדרה. הכנס את שיני מלקחיים בזווית של 90 מעלות לדורה דרך החורים לעומק של 1 מ"מ מסומן על הצדדים של המלקחיים, כדי לוודא שהסימן הוא מעל הדורה. לצבוט לסגור את המלקחיים וחזקים למשך 10 שניות. מלקחיים שחרור, וחזור על הפעולה לסחוט עוד פעמים עבור הסכום כולל של שלוש מחזיק. הסר מלקחיים מחוט השדרה. משרים חתיכת ספוג ג'לטין דחוסה נספג במלח ומניחים על גבי אתר פציעה. שימוש בתפר פועל, תפר את השריר במקום מעל laminectomy וספוג ג'לטין ספוג במס '4 תפרי ניילון שאינו נספגים סינטטיים. קליפ העור במקום באמצעות CLI פצע 5 מ"מps. הזרק 10 μl Marcaine (1.0 מ"ג / קילוגרם) ב490 μl של תת עורי מלוח סביב אתר החתך וBupernex (0.1 מ"ג / קילוגרם) 5 μl לשריר לשרירי הישבן. לאפשר לבעלי החיים להתאושש על משטח חם ולפקח על קשיים בכל תנועה או סימנים של שיתוק בגפיים האחורי. אל תשאיר חיה ללא השגחה או בנוכחותם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין מן ההרדמה. אין להשתמש בכל בעלי חיים המציגים גירעונות מנוע נצפים. הערה: למרות שנגע למעוך זה יכול להתבצע בכל רמה לאורך חוט השדרה, כמעט, T10-L4 מציב אתגרים טכניים פחות הדמיה ביחס לנשימה וייצוב תנועת גוף באמצעות מהדק. מיקום קלאמפ חייב להיות שונה סביב כלוב הצלעות לתמונה ברמות החזה. 4. Intravital הדמיה הכן וחיטוי כלים כירורגיים, כוללים מלקחיים דומון # 4, איריס מספריים, מלקחיים להחזקת רקמות, ד מחטנהרות וקליפים פצע. להרדים את העכבר כמו קודם עם isoflurane. לגרום הרדמה ב4-5% ולשמור על 1-2% לפי צורך כדי לשמור על קצב נשימה של 60-100 נשימות לדקה וחוסר התגובה לקמצוץ רגל. שמור את העכבר מחומם, לפקח על קצב נשימה כאשר לא הדמיה ולפקח באופן רציף בטמפרטורה של בעלי חיים עם בדיקה רקטלית. נקה את העור סביב קליפים פצע עם פולידין ולאחר מכן אלכוהול ולהסיר את סרטוני פצע על פי הוראות יצרן. ברגע קליפים פצע יוסרו, להסיר שיער עם נאיר במידת הצורך ולנקות את האתר שוב עם אלכוהול povidone- יוד ו- 70%. לפתוח מחדש את העור עם מספריים. הסר את כל תפרים שנותרו משריר ולמשוך שריר בנפרד עם מלקחיים, גזירה במספריים במידת צורך. תחת מיקרוסקופ לנתח, ליצור כיסים לחוט השדרה מלחציים על ידי חיתוך השרירים במספריים בצד של התהליכים הרוחביים ברמת חולית חוליה אחת מעל ומתחת לLaminectomy. הנח מלחציים סביב כל אחד מחוליה אלה ולהדק. להתאים לפי צורך, כדי לאפשר מקום למטרת מיקרוסקופ כדי להגיע לחוט השדרה. ודא שחוט השדרה הוא במקביל לפלטפורמת ההדמיה, ולשמור על יציבות רקמה להדמיה. אם חפץ נשימה נתפס, להסתגל מלחציים בהתאם למזעור תנועה בתחום ההדמיה. לכסות את ווי התלייה עם parafilm. הסר את ספוג ג'לטין דחוס נספג מחוט השדרה עם מלקחיים, בעדינות להרים את חתיכות רבות ככל האפשר, גם הסרת כמה שיותר רקמת צלקת מרחבי קרומי המוח ככל האפשר. כיסוי נחשף חוט השדרה עם מי מלח וספוג חדש במידת הצורך. הערה: אם דימום מתרחש מהשרירים המקיפים, או נלהב עם ספוג או לצרוב במידת הצורך. עם זאת, יש להיזהר שלא לגעת בחוט השדרה עם כויה. מכסה את חוט השדרה עם או פיסת רקמה לחה או ספוג ג'לטין דחוס כאשר צריבה. צור well להחזיק את נוזל הטבילה על ידי האיטום ראשון עור ורקמות עם Vetbond, ולאחר מכן באמצעות אקריליק שיניים לבנות גם בין שני מלחציים של בעל חוט השדרה והצדדים של בעלי החיים. חכה עד שתרופות אקריליק. מלא היטב עם נוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF) ולבדוק שוב לכל דימום סביב אתר הניתוח. לחלופין, בשלב זה, להזריק צבעי ניאון כלי לוריד על ידי הזרקה לוריד זנב כדי להדגיש את כלי הדם במהלך הדמיה. הערה: dextran פלורסנט מעל 70 kDa משמש לעתים קרובות, למרות נקודות קוונטיות וקטינים שכותרתו fluorescently משמשים גם צבעי כלי שימושיים. 50 μl של 150,000 WM TRITC-dextran מוזרק לוריד בדרך כלל. כדי להשיג תנועתיות תא חיסוניים רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, הטמפרטורה של העכבר חייבת להישמר על 37 מעלות צלזיוס. הזז את העכבר לסביבה מבוקר טמפרטורה מתחת למיקרוסקופ הדמיה ולפקח על בעלי החיים לanes הנכוןרמת thesia בשיעור נשימה וקמצוץ רגל. לפקח על בעלי החיים בתדירות גבוהה במהלך הדמיה כדי לקבוע עומק ההרדמה, במטרה להשיג קצב נשימה של 60-100 נשימות לדקה. אתר את אתר ההדמיה באמצעות עינית המיקרוסקופ. התאם את מיקרוסקופ סריקת לייזר 2-הפוטון לקחת תמונת Z- מחסנית כל שניות 30-60 לקבל נתונים הדמיה דינמיים. ברגע שפגישת הדמיה תושלם להסיר את החיה מהתיבה המחוממת. שחרר את ווי התלייה השדרה ולהסיר את העכבר מהמהדק. משוך אקריליק גם במרחק של העור תוך הסרת מהדק. אם העכבר הוא להיות צילם שוב, מקום ספוג ג'לטין הדחוס מלוח ספוג על חוט השדרה. סגור את השרירים ועור מעל אתר הניתוח. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה או בנוכחותם של בעלי חיים אחרים בעודו מחלים מהרדמה. אם החיה מראה סימנים של חסר נוירולוגים לאחר התאוששות, צריכים להיות מורדמים בעלי החיים. אחרת, להרדיםהעכבר בתא CO 2 לפני שהוא עולה מהרדמה על פי פרוטוקול שאושר על-המתת חסד IACUC. ניתוח תמונות ניאון באמצעות תוכנת ניתוח תמונה על ידי ביצוע הוראות היצרן.