マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

注：すべての動物が飼育し、機関の動物管理使用委員会（IACUC）に従って利用されるべきである。ここで説明するすべての手順は、ケースウエスタンリザーブ大学IACUCによって承認されている。 1.トランスジェニック動物軸索（汝-1 YFP H）50及びミクログリア/単球（;材料のリストを参照してくださいCX3CR1 GFP / GFP 51）を標識するために市販の蛍光レポーターマウスを使用してください。これらのマウスは、交配や制度動物ケアポリシーに従って個々の繁殖コロニーとして維持されるべきである。 2.骨髄キメラレシピエント動物として使用するための年齢の少なくとも8週間である動物を同定する。 でも、全身照射を確保する立場にマウスを保持するように設計された円形照射保持ケージに宿主動物を置きます。 セシウムにタイマーを設定し（CS-137）全身放射線DOSを管理するための照射製造業者の指示に従って動物に800〜ラドの年齢（ここに示す例は980ラドである）。 4時間の最小値のために休むために彼らのケージに動物を返します。 適切な遺伝子型のドナー動物を選択する骨髄前駆細胞の供給源として（ 図2A参照 ）。 注記：適切なドナーが異なる細胞集団、またはコントロールと同じ遺伝子型のいずれかを識別するために、ホストから別の系統特異的蛍光レポーターを表現する動物である。 1ペトリ70％アルコールとの皿、および10ミリリットルロズウェルパーク記念研究所（RPMI）メディアおよびメディアに浸し40μmのセルストレーナーを持つ第二の皿を埋める。 RPMI培地で15ミリリットルコニカルチューブを埋める。氷の上で料理やチューブを保管してください。 施設のガイドラインに従ってCO 2窒息によりドナー動物を生け贄に捧げる。すべての毛皮が濡れになるまで70％エタノールで全体の動物を浸すことによって、皮膚や毛を清掃してください。 SKの削除中央部分の周りにカットすると、完全に脚の筋肉を露出するように後ろ足の上に皮膚をプルダウンすることによって、動物の下半分からで。 、骨を脱臼その後滅菌ピンセットやハサミ、皮を使用し、脛骨の両端から離れて筋肉をカットして膝関節の前方過伸展による脛骨を削除します。メディアを含むペトリ皿の内側セルストレーナーに転送後、最大30秒間アルコールでペトリ皿に骨を置きます。 股関節を脱臼し、大腿骨に付着した筋肉をはが​​し、アルコールで簡単に大腿骨を入れ、次いで、皿内部の同じセルストレーナーに入れてください。 組織培養フード内で、骨の両端を切断し、骨の端部に1mlシリンジに21ゲージの針を挿入するために、滅菌ハサミを使用。メディアと15ミリリットルコニカルに骨髄をフラッシュします。残りの骨のための手順を繰り返します。 3ミリリットルの注射器からプランジャーのバックを使用して、クラッシュの骨は、セルで終わるより多くの細胞を抽出するためのペトリ皿にストレーナー。 50ミリリットルコニカルチューブの上にフィルターを置き、15ミリリットルコニカルチューブから吸引細胞とメディアを転送。単一細胞懸濁液を得るために、骨髄を粉砕するプランジャの背部を使用する。 50ミリリットルコニカルチューブにメディアの30ミリリットルと15ミリリットルの円錐管、骨片とセルストレーナーを洗ってください。 遠心ペレット細胞に500×gで5分間、細胞。 アンモニウム、塩化物カリウム2分間（ACK）溶解緩衝液2 mlの溶解赤血球。 10％ウシ胎児血清を含む培地10mlの溶解緩衝液をクエンチする。ペレットに5〜10分間500×gで遠心し。 各洗浄のためにペレット化する5〜10分間500×gで遠心分離し、生理食塩水で一度RPMI培地10ml中や細胞を2回洗浄する。 生理食塩水200μl中3×10 6細胞の最終濃度になるように細胞を再懸濁する。 滅菌済に尾静脈注射を介して転送3×10 6個の骨髄細胞adiatedレシピエントマウス。 受信者のケージに酸性化した水（pHは3.0）を配置し、マウスが回復することができます。 注：移植は、処置後10〜14日以内に死亡するが失敗したマウス。 8週間後、フローサイトメトリー（ 図2B-C）を用いて末梢血免疫細胞を調べることにより、骨髄再構成を検証する。 3.背列圧挫注：目的の実験に基づいて、適切なキメラ動物または手術のための二重トランスジェニック動物を選択してください。どちらラベル居住者または骨髄由来の細胞と動物は、前のステップで作成されました。 準備し、骨鉗子、デュモン＃4鉗子、アイリスはさみ、組織、針ドライバと創傷クリップを保持するための鉗子を含むオートクレーブ手術器具、。 疼痛コントロールのためのマウスに投与するために薬を準備します。 Bupernexとマーカイン、一般的に疼痛管理のために使用される。必要に応じて、適切な薬を使用してくださいND施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認。 4％イソフルランで麻酔を誘導し、毎分60〜100回の呼吸呼吸速度を達成するために、1〜2％イソフルランで維持する。麻酔下での乾燥を防ぎ、足のピンチによる応答がないことを確認するために、動物の目に目の潤滑剤を適用します。加熱パッドを使用して温度を維持し、直腸プローブを用いて温度を監視する。 目標と脊髄レベル以上の電気シェーバーでマウスの背中を剃る、その後2回70％アルコールに続いてポビドンヨードで面積を3回綿棒。無菌ドレープで動物を置き、手術部位を可視化するために適切な位置で切断穴を持つ別の滅菌ドレープで動物をカバーしています。手術を通して無菌ドレープ上のすべてのツールを維持します。 動物の背中に筋肉を露出するようにアイリスハサミで希望の脊髄レベルでの正中線に沿って皮膚をカット。 ディスの下で顕微鏡をecting、僧帽筋、彼らは背側脊髄のプロセスにアタッチし、脊柱を公開正中線に沿って広背筋の靭帯を含め、背中の筋肉をカット。 特定の椎骨の椎弓板を明らかにするために椎骨の背側及び横突起間の回旋筋を除去すること（この場合、T11）が除去される。このプロセスへの最後の非浮動リブの挿入によりT11を特定します。 削除するプロセスの上下にスペースに骨鉗子の先端を挿入し、彼らは、椎弓板の周りに所定の位置にしっかりしていることを確認しかし背骨を傷つけるには余りにも深くないように少し持ち上げます。ラミナを除去するための1回の移動で閉じる骨鉗子。 残りの椎骨の小さな部分を除去する骨鉗子を使用して、必要に応じて椎弓切除術を拡大。 定規に対してそれらを保持し、永久的なマーカーでマークすることで、＃4鉗子の先端から1ミリメートルを測定します。分離賭けで1ミリメートルを測定します定規に対する鉗子を保持することにより、2つの歯をWEENと鉗子のシャフトを介して、所定の位置にゴム製の鉗子リングをスライドさせて1ミリメートルの先端の最大幅を修正。 脊髄にアクセスするために鉗子の歯のための2つの挿入箇所で硬膜を通して30ゲージの針を挿入することにより、小さな穴を作成します。 マークは硬膜の上にあることを確認しながら、鉗子の側面にマークさ1ミリメートルの深さに穴を通して硬膜に90°の角度で、鉗子歯を挿入します。鉗子を閉じ、10秒間保持するピンチ。リリース、およびリピート鉗子は、3の合計を保持するためさらに2回を絞る。脊髄から鉗子を外します。 損傷部位の上に生理食塩水、所定の位置に吸収性ゼラチン圧縮スポンジの一片を浸す。 ランニングステッチを使用して、＃4、合成非吸収性のナイロン縫合糸で椎弓切除と浸したゼラチンスポンジの上に所定の位置に筋肉を縫合。 5ミリメートルの傷のCLIを使用して所定の位置に肌をクリップPS。 臀筋に筋肉内切開部位を中心に生理食塩水を皮下の490μlの10μlのマーカイン（1.0ミリグラム/ kg）を注入し、5μlのBupernex（0.1 mg / kgを）。 動物は暖かいパッド上で回復し、後肢のあらゆる動きの難しさや麻痺の兆候を監視することができます。完全に麻酔から回復するまで無人または他の動物の存在下で動物を放置しないでください。観測可能な運動障害を表示し、任意の動物を使用しないでください。 注：このクラッシュ病変は脊髄に沿った任意のレベルで実行することができますが、実際には、T10-L4は、呼吸に対するイメージングのためのより少ない技術的な課題を提起し、クランプを使用して体の動きを安定させる。クランプ配置は、胸部レベルで画像に胸郭の周りに変更する必要があります。 4.生体内イメージング準備し、デュモン＃4鉗子、アイリスはさみ、組織を保持するための鉗子、針Dを含むオートクレーブ手術器具、河川や創傷クリップ。 イソフルランで以前のようにマウスを麻酔。 4~5％で麻酔を誘導し、毎分60〜100回の呼吸の呼吸数と足のピンチに応答性の欠如を維持するために必要に応じて1~2％で維持する。加熱されたマウスを維持イメージングない呼吸数を監視し、連続的に、直腸プローブを用いて動物の温度を監視する。 ベタジンで創傷クリップの周りの皮膚をきれいにした後、アルコール及び製造業者の指示に従って、創傷クリップを削除します。巻かれたクリップが削除されると、必要に応じてNairさんで髪を削除し、ポビドンヨードおよび70％アルコールで再びサイトをクリーニングします。 ハサミで皮膚を再オープンします。筋肉から残りの縫合糸を外し、ピンセットで離れて筋肉を引っ張って、必要に応じてハサミでカットする。 解剖顕微鏡下、脊髄つの椎骨レベルラミの上下の椎骨上の横突起の側にはさみで筋肉を切断してクランプするためのポケットを作成するnectomy。 これらの椎骨の周囲クランプを取り付けて、締め。脊髄に到達するために顕微鏡の対物レンズのスペースを確保するために、必要に応じて調整します。脊髄は、イメージングプラットフォームに平行であることを確認し、イメージングのための組織の安定性を維持する。呼吸アーチファクトが見られた場合は、撮像視野の動きを最小限にするためにそれに応じてクランプを再調整する。 パラフィルムでクランプをカバー。 また、可能な髄膜上からできるだけ多く瘢痕組織を除去し、繊細に、できるだけ多くの作品をオフにピッキング、鉗子を用いて脊髄から吸収性ゼラチン圧縮スポンジを削除します。必要に応じてカバーは生理食塩水と新しいスポンジで脊髄を露呈した。 注：すべての出血はスポンジで忠実なことも、必要に応じて焼灼いずれか、周囲の筋肉から発生した場合。しかし、焼灼と脊髄に触れないように注意してください。焼灼時浸したティッシュペーパーまたはゼラチン圧縮スポンジの部分のいずれかと脊髄を覆う。 WELを作成最初Vetbondで皮膚および組織をシールし、次によく脊髄ホルダー二クランプおよび動物の側の間を構築するために歯科用アクリルを使用して、液浸流体を保持するためのリットル。アクリルが硬化するまでお待ちください。 人工脳脊髄液（aCSFの）とよくを記入し、手術部位周辺での出血のために再度確認してください。 任意で、この時点で、撮像中の血管を強調するために尾静脈注射によって静脈内蛍光血管色素を注入。 注：量子ドット、蛍光標識されたレクチンはまたとして有用な血管染料を果たすが、70 kDaの上記蛍光デキストランは、多くの場合、使用されている。 15万WM TRITCデキストラン50μlのは、一般的に静脈内注射する。 生理学的に関連する免疫細胞の運動性を得るために、マウスの温度を37℃に維持されなければならない。イメージングのために、顕微鏡下で温度制御された環境にマウスを移動し、正しいanesために動物を監視呼吸数と足のピンチによってthesiaレベル。毎分100回の呼吸 – 60の呼吸速度を目指し、麻酔の深さを決定するために、撮像中に頻繁に動物を監視する。 顕微鏡の接眼レンズを通して撮影部位の位置を確認します。 動的撮像データを取得する毎に30〜60秒のzスタック画像を撮影するために2光子レーザー走査顕微鏡を調整する。 撮像セッションが完了すると、加熱された箱から動物を削除する。 脊髄クランプを緩め、クランプからマウスを取り外します。クランプを除去しながらも肌からアクリルを引き出します。 マウスを再度画像化する場合には、脊髄の上に生理食塩水に浸したゼラチン圧縮スポンジを置く。手術部位の上の筋肉と皮膚を閉じます。麻酔から回復しつつ無人または他の動物の存在下で動物を放置しないでください。動物は回復後に神経障害の兆候を示している場合は、動物を安楽死されるべきである。それ以外の場合は、安楽死させるCO 2チャンバー内のマウスは、それがIACUCが承認した安楽死プロトコルに従って麻酔から出てくる前に。 製造業者の指示に従って、画像解析ソフトを用いた蛍光画像を解析する。