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Abstract
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神经科学

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Published: November 23, 2014
doi:
10.3791/52228
, , ,
1Department of Neurosciences,Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics,Case Western Reserve University

Summary

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Abstract

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Introduction

Die Entzündungsreaktion auf einer Erkrankung oder Verletzung im zentralen Nervensystem (ZNS) ist wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Wechselwirkungen zwischen Immun- und residenten Zellen innerhalb des Gewebes. Untersuchungen dieser zellulären Interaktionen im Rückenmark sind von besonderem Interesse in dem lebenden Tier. Der einzige leicht zugänglich CNS weiße Substanz-Trakt ist im dorsalen Säulen der Wirbelsäule, so dass dies ein wichtiges Gebiet, auf dem sich auf die Verbesserung machbar experimentellen Ansatz konzentrieren. Diese Untersuchungen haben aufgrund der technischen Schwierigkeiten beim Zugang zu und zur Stabilisierung des ZNS für die Bildgebung begrenzt. Live-Bildgebung im Rückenmark wurde in einer Verletzung des Rückenmarks über ein paar Stunden nach der ersten Beleidigung beschrieben zuvor 1-13, jedoch nur wenige Studien haben angesprochen Zellbewegung. Die traumatische Querschnittlähmung ist eine komplexe Umgebung, mit Neuronen, Astrozyten, Fibroblasten, NG2 Vorläuferzellen und Immunzellen including Mikroglia, Neutrophilen, Makrophagen, T-Zellen, B-Zellen und dendritischen Zellen 14,15. Makrophagen sind die Teilmenge der Immunzellen für die Phagozytose in der Läsion verantwortlich Infiltrieren aus der Zirkulation. Die Rolle dieser phagozytischen Zellen ist diskutiert worden, mit Berichten hervorgeht, dass diese Zellen sowohl schädlich und Schutzrollen in das verletzte Gewebe zu nehmen. Diese Rollen reichen von steigenden sekundären axonalen Sterben nach einer Verletzung und in einer Art und Weise phagozytischen 16-22 handeln, die Annahme auf einer Wundheilungs Phänotyp und abnehmende Funktionsdefizite in der verletzte Tier 21,23,24.

Zuvor versucht, Makrophagen von Mikroglia in erster Linie auf die Morphologie in gesundem Gewebe verlassen zu unterscheiden. , Aktivierte Mikroglia und Makrophagen exprimieren jedoch viele der gleichen Markierungen und Anzeige unterscheiden Morphologie nach einer Verletzung 25-29, so dass die Trennung der verschiedenen Aktivitäten dieser Zellen schwer zu studieren based auf diese Faktoren allein 30. Diese Zellen können durch differentielle Expression von CD45 mit Durchflusszytometrie 33,34 getrennt werden, wobei diese Vorgehensweise ist bei der Unterscheidung dieser Zelltypen in vivo weniger nützlich. Verwendung differentielle Expression von CCR2 und CX3CR1 Mikroglia und Makrophagen wurde ebenfalls untersucht, obwohl die dynamischen Veränderungen in der Expression dieser Marker Monozyten differenzieren sich zu Makrophagen genaue Analyse 35,36 erschweren. Mikroglia sind die Immunzellen Wohnsitz im ZNS und ergeben sich aus Dottersack Vorläuferzellen während der fetalen Entwicklung, während Makrophagen aus Knochenmarksvorläuferzellen abgeleitet und geben Sie den verletzten ZNS nach einer Beleidigung 31,32. Ein alternativer Ansatz zur Verwendung von Morphologie, diese beiden Zelltypen zu unterscheiden, ist das Knochenmark mit Vorläufern von einem Spendertier ersetzen exprimieren eine nachweisbare Markierung in die Makrophagen aus den Donor-Vorläufer abgeleitet ist, unter Beibehaltung des CNS resident, recipabler abgeleitete Mikroglia. Diese Knochenmarks chimären Modelle sind allgemein bei vielen anderen Anwendungen 37-40 verwendet. Dieses Verfahren hat eindeutige Einschränkungen mit Verletzung der Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch Bestrahlung oder zytotoxische Medikamente zur Markvorläuferzellen zu beseitigen im Wirt, wodurch seine Verwendung in bestimmten Applikationen Begrenzungs verursacht sind. In letzter Zeit werden funktionale Unterschiede zwischen Mikroglia und Makrophagen im zentralen Nervensystem beginnen, mit Hilfe der Durchflusszytometrie, Gen-Chip-Array-Analyse und Chimärismus Methoden 24,26,41-44, die sehr nützlich in der Zukunft erweisen wird erkennbar. Obwohl die Trennung dieser beiden Zelltypen schwierig bleibt, ist das Verständnis ihrer einzigartigen Funktionen, die zu zielgerichteten Behandlungs von Erkrankungen, die sowohl Mikroglia und Makrophagen im ZNS beteiligt wichtig.

Beschreibung von zellulären Wechselwirkungen innerhalb der Läsion des Rückenmarks wurde hauptsächlich aus Untersuchungen, die Zellkultur-Modellen kommen. Dies ist due auf die Herausforderungen, mit bildgebe sowohl der Querschnittlähmung und Immunzellen zusammen in einem lebenden Tier beteiligt. Aktuelle Nagetiermodellen von Rückenmarksverletzungen von unterschiedlicher Art und Schwere sind Prellung Modelle 45,46, Pin-Stichverletzungen 2, Platzwunde 47 und die hier beschriebenen 16,18,48 dorsalen Säule Quetschverletzungen. Entzündung in der Hirnhaut steigt mit der Schwere der Verletzung und stellt besondere Herausforderungen für die Implantation von Fenstern oder Operationen für serielle Bildgebung. Einige dieser Herausforderungen sind: die Infiltration von Phagozyten als auch die Erzeugung von Fasergewebe über der Operationsstelle. Einige dieser Probleme können durch die Schaffung von kleineren Läsionen und für den freiliegenden Rückenmark mit nicht immunogen Wundversorgung zwischen Dura und den paraspinous Muskeln, um die spätere Wiedereröffnung der Operation ermöglichen überwunden werden, wie hier getan wird, um die Hinterstrang Quetschverletzung studieren . Die Fähigkeit, Bild nur die dorsale Teil des Spin-al Kabel begrenzt auch die Wahl der Verletzung, da Prellung Modelle in erster Linie verursachen Schäden am Zentralstecker, oft Schonung der meisten dorsalen Teil der Hinterstränge, insbesondere zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung 45,49. Daher beschreiben wir eine einfache Verletzungsmodell, das eine saubere, wiederholbare, rechteckig geformte Läsionen, die für sowohl die Beobachtung der Zellbewegung innerhalb der Verletzung, und für eine einfache Quantifizierung von axonalen Position relativ zu der Läsion ergibt.

Protocol

HINWEIS: Alle Tiere sollten untergebracht und in Übereinstimmung mit der Tierpflege und Verwendung Ausschuss (IACUC) in der Einrichtung genutzt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren werden von der Case Western Reserve University IACUC zugelassen. 1. Transgene Tiere Verwenden Sie handelsüblichen fluoreszierenden Reporter-Mäuse zu Axonen (Thy-1 YFP H) 50 und Mikroglia / Monozyten kennzeichnen (CX3CR1 GFP / GFP 51; siehe Liste der Materialien). Diese Mäuse sollte gekreuzt und als einzelne Brutkolonien nach institutionellen Tierpflegerichtlinien eingehalten werden. 2. Knochenmark-Chimären Identifizierung der Tiere, die mindestens 8 Wochen für den Einsatz als Empfängertiere sind. Zeigen Wirtstiere in einer kreisförmigen Bestrahlung Haltekäfig entwickelt, um die Maus in einer Position zu halten, um auch, Ganzkörperbestrahlung zu gewährleisten. Zeitschaltuhr auf eine Cäsium (Cs-137) Bestrahlungs eine ganze Körperstrahlung dos verwaltenAlter von 800-1.000 Rads an die Tiere nach Herstellerangaben (Beispiele hier gezeigten Rads 980). Zurück Tiere in ihre Käfige für mindestens 4 Stunden ruhen. Wählen Spendertieren der entsprechenden Genotyp (siehe 2A), als die Quelle der Mark-Vorläuferzellen. HINWEIS: Die entsprechenden Spender sind Tiere, die verschiedene linienspezifischen fluoreszierenden Reporter von dem Host zu verschiedenen Zellpopulationen oder eine des gleichen Genotyps als Kontrollen zu identifizieren. Füllen einer Petrischale mit 70% Alkohol, und eine zweite Schale mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medien und einer 40 um Zellsieb in den Medien eingeweicht. Füllen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen mit RPMI-Medium. Halten Sie die Gerichte und Röhrchen auf Eis. Opfern die Spendertiere von CO 2 Ersticken gemäß gültiger Richtlinien. Reinigen Sie die Haut und das Fell durch Einweichen der gesamten Tier mit 70% Ethanol bis alle Fell nass ist. Entfernen Sie die skin vom unteren Hälfte des Tieres durch Schneiden um den mittleren Teil und ziehen die Haut nach unten über die Hinterbeine, um die Beinmuskulatur vollständig freizulegen. Entfernen Sie die Tibia durch vordere Überdehnung im Kniegelenk, um den Knochen verrenken, dann mit einer sterilen Pinzette und Schere, schälen und Muskeln von beiden Enden der Tibia. Legen Sie die Knochen in der Petrischale mit Alkohol für bis zu 30 Sekunden, dann Transfer zum Zellsieb in der Petrischale mit den Medien. Verrücken das Hüftgelenk und abziehen, die Muskeln auf den Oberschenkelknochen befestigt, platziert den Oberschenkelknochen kurz in Alkohol und dann legen Sie sie in der gleichen Zelle Sieb in der Schüssel. In einer Gewebekultur Kapuze, verwenden sterilen Schere abzuschneiden beide Enden der Knochen und legen Sie eine 21-Gauge-Nadel auf einer 1-ml-Spritze in das Ende des Knochens. Spülen Sie die Mark in den 15-ml-Erlen mit Medien. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Knochen. Verwendung der Rückseite des Kolbens aus einer 3 ml-Spritze endet Stauch Knochen in der ZellSieb auf der Petrischale mehrere Zellen zu extrahieren. Setzen Sie den Filter auf einem 50 ml konischen Röhrchen und übertragen Sie Medien mit abgesaugt Zellen aus dem 15 ml konischen Röhrchen. Benutzen Sie die Rückseite des Kolbens, um das Mark, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, zu zerschlagen. Die 15 ml konischen Röhrchen, Knochenfragmente und die Zelle-Sieb mit 30 ml Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen waschen. Zentrifugiere die Zellen 5 min bei 500 × g Zellen zu pelletieren. Lyse der roten Blutzellen, die mit 2 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer für 2 min. Quenche die Lysepuffer mit 10 ml Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum. Bei 500 xg für 5 bis 10 min zu pelletieren. Wasche die Zellen einmal in 10 ml RPMI-Medium und zweimal in Kochsalzlösung, Zentrifugieren bei 500 × g für 5-10 Minuten für jeden Waschvorgang zu pelletieren. Die Zellen in einer Endkonzentration von 3 x 10 6 Zellen in 200 ul Kochsalzlösung. Über 3 x 10 6 Markszellen über die Schwanzvene Injektion in irradiated Empfängermäuse. Zeigen angesäuertem Wasser (pH 3,0) in den Empfänger Käfig und lassen Mäusen zu erholen. HINWEIS: Mäuse, die die Transplantation wird innerhalb von 10-14 Tagen nach dem Eingriff zu sterben scheitern. Nach 8 Wochen überprüfen Mark Rekonstitution durch die Untersuchung des peripheren Blutes Immunzellen mittels Durchflusszytometrie (2B-C). 3. Rücken Spalte Quetschverletzung HINWEIS: Wählen Sie die entsprechende Chimäre Tiere oder Doppel transgene Tiere für die Operation auf der Grundlage des gewünschten Experiments. Tiere entweder mit der Bezeichnung ansässig oder Knochenmark-Zellen wurden in vorherigen Schritten erstellt. Vorbereitung und Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich Rongeure, Dumont # 4 Pinzetten, Iris Scheren, Pinzetten zum Halten Gewebe, Nadeltreiber und Wundklammern. Bereiten Medikamente den Mäusen Schmerzkontrolle zu verabreichen. Bupernex und Marcain werden üblicherweise zur Schmerzkontrolle verwendet. Verwenden Sie geeignete Medikamente wie erforderlich einnd von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. Induzieren Anästhesie mit 4% Isofluran und halten mit 1-2% Isofluran, eine Atemfrequenz von 60 bis 100 Atemzüge pro min zu erreichen. Bewerben Auge Schmiermittel die Augen des Tieres bis zur Trockenheit unter Narkose zu verhindern, und bestätigen Sie fehlende Reaktion zu Fuß Prise. Pflegen Sie die Temperatur mit einem Heizkissen und die Temperatur mit einem rektale Sonde überwachen. Rasieren Sie die Rückseite der Maus mit einem elektrischen Rasierer über die gezielte Rückenmarksebene und dann dreimal Wischen Sie die Fläche mit PVP-Jod, gefolgt von zweimal mit 70% igem Alkohol. Legen Sie das Tier auf einem sterilen Tuch und decken das Tier mit einem anderen sterilen Tuch mit einem Loch an einem geeigneten Ort, um die Operationsstelle zu visualisieren geschnitten. Behalten Sie alle Tools auf sterilen Tüchern in der gesamten Operation. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie an der gewünschten Rückenebene mit Iris Schere, um die Muskeln auf der Rückseite des Tieres aus. Unter einem dissektierender Mikroskop, schneiden Sie die Rückenmuskulatur, einschließlich des Trapezius und der Bänder des großen Rückenmuskeln entlang der Mittellinie, wo sie auf die Rückendornfortsätze anzuhängen, und setzen die Wirbelsäule. Entfernen Sie die Rotatoren zwischen den dorsalen und Querfortsätze der Wirbelkörper, um die Schicht des spezifischen Wirbel offenbaren entfernt werden (T11 in diesem Fall). Identifizieren T11 durch das Einsetzen der letzten nicht-schwimmende Rippe auf diesen Prozess. Legen Spitzen Rongeure in den Raum über und unter dem Prozess entfernt und leicht anheben, um sicherzustellen, dass sie sicher an ihrem Platz auf der Wirbel Lamina aber nicht zu tief, um die Wirbelsäule verletzen. Schließen Rongeure in einer Bewegung, die Lamina zu entfernen. Vergrößern Sie die Laminektomie, wie mit Hilfe der Knochenzangen, um kleine Teile des Restwirbel zu entfernen benötigt. Messen Sie 1 mm von den Spitzen einer Pinzette # 4 von gegen einen Herrscher hielt sie und Markieren mit einem wasserfesten Stift. Messen Sie ein 1 mm in Trennung Wetteschen den beiden Zinken durch Halten der Zange gegen den Herrscher und befestigen Sie die maximale Breite der Spitzen bis 1 mm, indem ein Gummiring Zange in Position über die Welle der Zange. Erstellung einer kleinen Öffnung durch den Einsatz eines 30-Gauge-Nadel durch die Dura an den beiden Punkten für die Zinken der Zange, um auf die Wirbelsäule. Legen der Zange Zinken in einem 90 ° Winkel zu der Dura durch die Löcher bis zu einer Tiefe von 1 mm an den Seiten der Zange markiert, so dass der Filter über der Dura. Klemmen Sie die Zange schließen und halten Sie für 10 Sekunden. Mitteilung, und wiederholen Sie die Zange quetschen zwei weitere Male für insgesamt drei hält. Pinzette entfernen aus dem Rückenmark. Genießen Sie ein Stück absorbierbarer Gelatineschwamm komprimiert in Kochsalzlösung und über den Verletzungsstelle. Mit einer Laufstich, Naht der Muskel anstelle über die Laminektomie und getränkt Gelatineschwamm mit # 4 synthetische nicht resorbierbares Nahtmaterial aus Nylon. Clip der Haut an Ort und Stelle mit 5 mm gewickelt clips. Injizieren 10 ul Marcaine (1,0 mg / kg) in 490 & mgr; l Kochsalzlösung subkutan um die Inzisionsstelle und 5 ul Bupernex (0,1 mg / kg) intramuskulär in den Glutealmuskulatur. Lassen Tier an einem warmen Pad erholen und Monitor für alle bei der Bewegung oder Lähmungserscheinungen in den hinteren Gliedmaßen. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in Gegenwart anderer Tiere, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Verwenden Sie keine Tiere, die beobachtbare motorische Defizite anzuzeigen. HINWEIS: Dieses Gedränge Läsion kann auf jeder Ebene entlang des Rückenmarks durchgeführt werden, praktisch, T10-L4 stellen weniger technischen Herausforderungen für die Bildgebung in Bezug auf die Atmung und die Stabilisierung Körperbewegung mit Schellen. Clamp Platzierung muss um den Brustkorb bei Brust Ebenen geändert werden, um Bild. 4. Intravital Imaging Vorbereitung und Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich Dumont # 4 Pinzetten, Iris Scheren, Pinzetten zum Halten von Gewebe, Nadel dFlüsse und Wundklammern. Betäuben die Maus nach wie vor mit Isofluran. Induzieren Anästhesie bei 4-5% und pflegen bei 1-2% je nach Bedarf, eine Atemfrequenz von 60 bis 100 Atemzüge pro Minute und ein Mangel an Reaktion auf Fuß Prise halten. Halten Sie die Maus beheizt, überwachen Atemfrequenz, wenn nicht die Abbildung und Tier Temperatur mit einem rektale Sonde kontinuierlich zu überwachen. Reinigen Sie die Haut um die Wundklammern mit Betadine und Alkohol und entfernen Sie die Wundklammern nach Herstelleranweisungen. Sobald Wundklammern entfernt werden, entfernen Sie die Haare mit Nair bei Bedarf und reinigen Sie die Website erneut mit PVP-Jod und 70% Alkohol. Wiederaufnahme der Haut mit einer Schere. Nehmen Sie die restlichen Nähte von Muskeln und ziehen Muskeln heraus mit Zangen, Schneiden mit der Schere, wenn nötig. Unter einem Präpariermikroskop Erstellen Taschen für das Rückenmark Klemmen durch Schneiden des Muskels mit einer Schere an der Seite der Querfortsätze an dem Wirbel eines Wirbelhöhe oberhalb und unterhalb der laminectomy. Zeigen Klammern um jede dieser Wirbel und festziehen. Nach Bedarf einzustellen, um Raum für Mikroskopobjektiv zu ermöglichen, die das Rückenmark zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass das Rückenmark parallel zur Imaging-Plattform ist, und Gewebestabilität für die Bildgebung zu halten. Bei Atem Artefakt gesehen, stellen Klemmen entsprechend auf Bewegung im Bildfeld zu minimieren. Decken Sie die Klemmen mit Parafilm. Entfernen Sie die absorbierbarer Gelatine komprimierte Schwamm aus dem Rückenmark mit einer Pinzette vorsichtig Abgreifen so viele Teile wie möglich, auch das Entfernen so viel von Narbengewebe in den Meningen, wie möglich. Abdeckung ausgesetzt Rückenmark mit Kochsalzlösung und neuen Schwamm, wenn nötig. HINWEIS: Wenn eine Blutung auftritt von der umgebenden Muskeln, entweder überzeugter mit Schwamm oder ausbrennen, wie gebraucht. , Nehmen Sie jedoch darauf, dass das Rückenmark mit dem Brenneisen berühren. Decken Sie das Rückenmark entweder mit einem Stück feuchten Gewebe oder Gelatine Schwamm zusammengedrückt, wenn Ausbrennen. Erstellen Sie eine well, um die Immersionsflüssigkeit durch erste Abdichtung der Haut und des Gewebes mit Vetbond und dann mit Zahnacryl den Aufbau einer gut zwischen den beiden Klemmen des Rückenmarks Halter und den Seiten des Tieres zu halten. Warten Sie, bis die Acryl Kuren. Füllen Sie das auch mit künstlichen Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) und klicken Sie hier für eine Blutung auf der Operationsstelle. Gegebenenfalls zu diesem Zeitpunkt einzuspritzen fluoreszierenden Gefäß Farbstoffe intravenös durch Injektion in die Schwanzvene, die Blutgefäße bei der Bildgebung zu markieren. HINWEIS: Fluorescent Dextran über 70 kDa wird häufig verwendet, wenn auch Quantenpunkte und fluoreszenzmarkierte Lektine als nützlich Schiff Farbstoffe dienen auch. 50 ul von 150.000 WM TRITC-Dextran wird typischerweise intravenös injiziert. Physiologisch relevanten Immunzellbeweglichkeit zu erhalten, muss die Temperatur der Maus bei 37 ° C gehalten werden. Bewegen Sie die Maus auf eine Temperatur kontrollierten Umgebung unter dem Mikroskop für die Bildgebung und Überwachung des Tier korrekte anesThesia Niveau von Atemfrequenz und Fuß Prise. Überwachen Sie das Tier häufig während der Bilderzeugung zu bestimmen, der Narkosetiefe, mit dem Ziel, eine Atemfrequenz von 60 zu erreichen – 100 Atemzüge pro Minute. Suchen Sie die Bildstelle durch das Mikroskop-Okular. Stellen Sie die 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop, um ein Bild Z-Stapel jede 30-60 Sekunden dauern, um dynamische Bilddaten zu erhalten. Sobald Bildgebungssitzung abgeschlossen ist entfernen Sie das Tier von der beheizten Box. Lösen Sie die Rückenklammern und entfernen Sie die Maus von den Klemmen. Ziehen Sie die Acryl gut von der Haut weg, während das Entfernen der Klemmen. Wenn die Maus wieder abgebildet werden, legen Sie Kochsalzlösung getränkt Gelatine Druck Schwamm über das Rückenmark. Schließen Sie die Muskeln und Haut über der Operationsstelle. Lassen Sie das Tier unbeaufsichtigt oder in Gegenwart anderer Tiere während der Genesung von Anästhesie. Wenn das Tier zeigt keine Anzeichen von neurologischen Defizit nach der Wiederherstellung, sollte das Tier eingeschläfert werden. Andernfalls einschläferndie Maus in einem CO 2 Kammer, bevor sie aus der Narkose tritt nach IACUC genehmigten Sterbehilfe-Protokoll. Analysieren Fluoreszenzbilder mit Bildanalyse-Software, indem Sie den Anweisungen des Herstellers.

Representative Results

Eine schematische Darstellung der dorsalen Säule Stauch Läsion ist in 1A gezeigt. Nach der Läsion wird das Tier hergestellt und intravitale Mikroskopie mit spinalen Klammern (1B) stabilisiert. Ein Bild unmittelbar nach der dorsalen Säule Quetschverletzung genommen wird, zeigt eine deutlich sichtbare rechteckigen Läsion mit einer Pinzette Zinken Einfügepunkte, die eindeutig identifizierbar sind. Axone an der Verletzungsstelle sind über die Spannweite der gesamten hinteren Säule (1C) durchtrennt wird. Die Integrität von Blutgefäßen erhalten bleibt und keine Hinweise auf eine Gefäß Austritt von Farbstoff wurde durch Fluoreszenz detektiert. Zur Serienbild der gleichen Läsion über Wochen durchzuführen, können die Muskeln und die Haut über der Laminektomie aus dem Wieder Exposition genäht werden. Ähnliche Läsion Morphologie zu späteren Zeitpunkten (1D, E) ersichtlich. 5 Tage nach der Verletzung, die Zange Insertionsstellen noch sichtbar, aber die Läsion hat damit begonnen, in der Größe d erhöhenue zu Sekundärschäden durch eine Entzündung verursacht. Die Axone am kaudalen Ende der Läsion wurden aus dem anfänglichen Ort der Verletzung durch ein Verfahren namens "axonale Absterben" eingefahren. Die Axone im rostralen Ende der Läsion zeigte Wallerian artigen Degeneration (1D, E). Zwischen den Tagen 5 und 22 nach der Verletzung, die Größe der Läsion stabilisiert. Gleichzeitig kann ein großer Zustrom von CX3CR1 + Zellen beobachtet Infiltrieren in und um die Stauch Läsion während dieser Zeitpunkte werden, obgleich die Identität dieser Zellen (Mikroglia gegen Makrophagen) nicht bei der Herstellung, wie in Figur 1 gezeigt unterscheidet. Um das Verhalten von Mikroglia und Makrophagen im Gedränge Läsion Mikroumgebung zu unterscheiden, wurde eine Strahlungs Chimäre Modell verwendet (in 2A beschrieben). Zuerst werden die Knochenmarksvorläuferzellen eines CX3CR1 + / GFP-Maus mit nicht-fluoreszierenden Donor-cel ausgetauschtls, also nur GFP + CNS fremde Mikrogliazellen sind durch Fluoreszenz-Bildgebung sichtbar. Die Effizienz des Mark Rekonstitution mittels Durchflusszytometrie Prüfung des peripheren Blutes 8 Wochen nach Marktransplantation (Abbildung 2B, C) ​​bestätigt werden. In 2B F4 / 80 und GFP-positive Makrophagen, in blau, in einem CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 chimären Maus erkannt wird, in dem einige GFP negativ, aber F4 / 80 positive Monozyten sind ebenfalls vorhanden. In 2C ohne doppelte positive F4 / 80 und GFP-positive Zellen sind nach dem Austausch CX3CR1 + / GFP Empfängerknochenmark mit Wildtyp-Knochenmark verlassen. Vor Verletzungen, sind Mikroglia gleichmäßig im Rückenmark verteilt Anzeigen eines ruhenden, verzweigten Morphologie (Figur 2D). 8 Tage nach Verletzung, kann nur ein paar Mikrogliazellen in und um die Läsion nachweisbar. Diese Mikrogliazellen zeigen eine amoeboid Morphologie (2E). Zweitens KnochenMark-Vorläuferzellen in einer nicht-fluoreszierenden Maus werden durch Knochenmarkzellen von einem CX3CR1 + / GFP-Maus ersetzt daher Rendering-Knochenmark stamm CX3CR1 + Monozyten / Makrophagen durch GFP-Fluoreszenz sichtbar ist (2A). Vor der Verletzung, die nur GFP + Zellen nachgewiesen sind weitgehend perivaskuläre, von denen berichtet wurde, um sein Knochenmark und ständig umdrehen regelmäßig 28 (2F). Nach Quetschverletzung kann CX3CR1 + / GFP Zellen entlang der Innenseite der Blutgefäße rund um die Läsion (2H-J) zu sehen ist, und die Läsion Zentrum ist mit infiltrierenden CX3CR1 + / GFP Makrophagen (2G) gefüllt. Zeitraffer-Aufnahme der dorsalen Säulen können für bis zu 6 Stunden durchgeführt werden. In Figur 3 wird gezeigt, eine nicht-chimären CX3CR1 + / GFP-Maus unmittelbar nach der Verletzung in dem Zellen aus dem Kreislauf zu sehen sein kannn Auszug aus dem Blutgefäß zu der Läsion Kern und die innerhalb der Verletzungsstelle (3A, B; Supplemental Film 1). Die Bildanalyse unter Verwendung der Fluoreszenzintensität um Zellen zu identifizieren können die Pfade durch Makrophagen (3A, B; Supplemental Film 1) genommen zu verfolgen. Statistik von der Bildanalyse abgeleitet zeigen die durchschnittliche Beweglichkeit der Makrophagen in der Läsion ist 3,6 um / min (3D). Schließlich wird bei 22 Tage nach der Verletzung, Axonen, Mikroglia und Makrophagen, kann innerhalb der Läsion zeigt den Bereich der Bildgebung detektiert werden soll über lange Zeiträume (Supplementary Movie 2) stabil. Abbildung 1: Aufbau und sequentielle Bildgebung des dorsalen Säule Quetschverletzungen. (A) Die RückenSpalte Quetschverletzung wird durch Entfernen der Dornfort des Wirbels auf der Ebene von Interesse durchgeführt. Zangen sind in den dorsalen Säule des Rückenmarks 1 mm voneinander eingesetzt und werden dann geschlossen 3 mal um den in lila dargestellt Läsion zu erzeugen. (B) Das Tier wird dann mit Rückenmark positioniert Schellen, um die Stabilität für intravital Bildgebung zu erhalten. (C) Unmittelbar nach der Verletzung, kann die Zange Insertionsstellen (rot oval) und der rechteckige Quetschverletzung Volumen (graue Box) eindeutig identifiziert werden. Axone in den dorsalen Wurzeln zu sehen ist (weiße Pfeile) sowie die verletzten Enden der Axone auf der kaudalen Seite der Läsion (gefüllte Pfeilköpfe). (D) 5 Tage nach der Verletzung, die Zange Insertionsstellen (rot oval ), und das Ausmaß der Läsion (grauer Kasten) noch leicht sichtbar gemacht werden. Die Läsion hat sich seit der ersten Beleidigung zu. Axone unterziehen Waller artigen Degeneration kann rostral zur Läsion (offene Pfeilspitzen) in additi sehenauf, um Axone in den hinteren Wurzeln (weiße Pfeile) und die Enden der verletzten Axone (weiße Pfeilspitzen). (E) 22 Tage nach der Verletzung, ist die Läsion noch erkennbar mit ähnlichen Abmessungen der Verletzung nach 5 Tagen. Achten Sie auf die große Anzahl von CX3CR1 + Zellen in und um die verletzte Stelle. Funktionen beschriftet sind die gleichen wie in (D). Alle Maßstabsbalken = 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 2: Aufbau von chimären Mäusen CX3CR1 + / GFP-exprimierenden CNS fremde Mikrogliazellen oder Knochenmark-abgeleitete Makrophagen in der dorsalen Säule verknallt Läsion zu verfolgen. (A) Eine schematische Darstellung des chimären Mäusen Erzeugung mit entweder CX3CR1 + / GFP exprimierenden microglia oder Makrophagen. Zuerst werden Thy-1 YFP H Mäusen bestrahlt und das Knochenmark wird mit Knochenmarkzellen von einem CX3CR1 + / GFP-Maus isoliert rekonstituiert, was zu einer chimären Maus, deren Makrophagen GFP +. Zweitens sind Thy-1 YFP H / CX3CR1 + / GFP-Mäuse bestrahlt und das Knochenmark wird mit Markzellen von einem nicht-fluoreszierenden Maus isoliert rekonstituiert, wodurch eine chimäre Maus, deren Mikroglia GFP +. (B) Beispiel eines Durchflusszytometrie Daten mit F4 / 80 + und CX3CR1 GFP + -Zellen in das Blut von einem chimären Tiers mit einem CX3CR1 + / GFP Markspender in einem bestrahlten C57BL / 6-Empfänger transplantiert. Zellen aus den CX3CR1 positiven Spendern, die positiv für sowohl GFP und F4 / 80 abgeleitet werden gezeigt in der blau unterlegt Bereich. (C) Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten mit F4 / 80 + und CX3CR1 GFP + -Zellen in einem chimären Tier mit einem C57BL6 Spendermark in eine ir transplantiertabgestrahlte CX3CR1 + / GFP Empfänger. Beachten Sie das Fehlen von Doppel-positive CX3CR1 + / GFP und F4 / 80 Zellen innerhalb der blaue markierte Bereich. (D) Ein Intravital Zwei-Photonen-mikroskopische Momentaufnahme einer Maus aus dem ersten chimären Schema und zeigt GFP + Mikroglia mit verzweigten Morphologie im Rücken Spalte (Pfeilspitze). Diese Zellen werden unter Axone (gelb) in der Hinterwurzel und der dorsalen Säule durchsetzt. Balken = 100 um. (E) Intravital Imaging der gleichen Maus in (B) von 8 Tagen nach dorsalen Säule Verletzungen offenbart ein paar CX3CR1 + Mikroglia mit großen und amoeboid förmigen Zellkörper, die ohne Verfahren (Pfeilspitze) sind. Balken = 100 um. (F) Snapshot einer Maus aus der zweiten chimären Schema in (A) und zeigt kaum GFP + Makrophagen, im ZNS Parenchym. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (G) Intra Abbildung der gleichen Maus (F) 8 Tage nach der dorsalen Säule Schädigung zeigt alArge Zustrom von Makrophagen in und um die Läsion. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (H) eine höhere Vergrößerung Bild CX3CR1 + Blut abgeleiteten Zellen in Kontakt mit den Behältern in der unversehrten Tier. Maßstabsbalken = 30 & mgr; m. (I) Eine Rekonstruktion CX3CR1 Zellen in Kontakt mit dem Behälter, aus dem Inneren des Behälters betrachtet wird. Maßstabsbalken = 30 & mgr; m. (J) Eine Rekonstruktion CX3CR1 Zellen in Kontakt mit dem Behälter, von außerhalb des Behälters betrachtet wird. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Abbildung 3 :. Vertreter Zell Tracking-Daten in einem nicht-chimären CX3CR1 + / GFP-Maus sofort nach dorsalen Säule verknalltVerletzung. Von den CX3CR1 + Zellen in (A) genommen (A) Eine Momentaufnahme der CX3CR1 + Mikroglia und Makrophagen rund beschädigt Axone (gelb) von Zusatz Film 1 unmittelbar nach einem dorsalen Säule Quetschverletzungen. (B) Die Wege (grau) in einem 110 min Intravital Imaging-Sitzung. (C) Eine Zeit codierte Darstellung der Tracks in (B). Spuren sind auf der Grundlage ihrer Zeit innerhalb der gesamten 110 Minuten Film gefärbt, wie in dem Zeitbalken angezeigt. (D) Histogramm der Gesamtbeweglichkeit der CX3CR1 + Zellen. Alle Maßstabsbalken sind 30 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. Ergänzende Film 1: Vertreter Intravital Film unmittelbar nach dem dorsalen Säule Quetschverletzung im Doppel heterozygote Thy-1 YFP / + <strong> / CX3CR1 GFP / + Maus. Intravitalrücken Bildgebung wurde unmittelbar nach einer dorsalen Säule Quetschverletzungen an T11-Ebene durchgeführt. Rechte Bild zeigt die Bewegung der CX3CR1 + Mikroglia und Makrophagen. Die Wege der Bewegung der Zellen werden als weiße Spuren auf der linken Seite gezeigt. Die Verletzung an der oberen linken Ecke. CX3CR1 + Zellen, in Reise in die Stelle der Verletzung entlang dieser Spuren werden. Axone sind in gelb dargestellt. Maßstabsbalken = 40 um. Gesamtzeit: 110 min. Die Wiedergabegeschwindigkeit: 300x. Ergänzende Movie 2:. Vertreter Intravital Film bei 22 Tagen nach dorsalen Säule verknallt Läsion im Doppel heterozygote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + Maus Abgebildet ist ein Vertreter Film in einer Maus 22 Tage nach der ersten dorsalen Säule verknallt genommen Verletzungen am Rückenebene T11. Die injry ist an der oberen rechten Ecke des Rahmens befinden. Axone (gelb) aufsteigend rostral werden unten rechts angezeigt. Die Dorsalvene und Blutgefäße sind mit TRITC-Dextran (rot) gekennzeichnet. CX3CR1 + Zellen innerhalb der Verletzung, bewegen sich mit einer geringeren Geschwindigkeit verglichen mit denen unmittelbar nach der Verletzung. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Gesamtzeit: 90 min. Die Wiedergabegeschwindigkeit: 600x.

Discussion

Imaging Wechselwirkungen verschiedener Zelltypen in ihrer Mutter Gewebekompartimente beim anschließenden Pathologie in Echtzeit hat großes Interesse erzeugt. Innerhalb des dichten Netz des ZNS, Zell-Zell-Kontakt und Signalisierung mit benachbarten Zellen essentiell für die normale Funktion und zum Verständnis ZNS-Pathologie. Hier haben wir beschrieben, die Verwendung von 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie für die Beobachtung der Zellbewegung innerhalb einer mechanischen Verletzung des Rückenmarks. Neben der Qualität der Chirurgie und Gewebepräparat, ist die mechanische Stabilität des Gewebes von größter Bedeutung für eine erfolgreiche Zeitraffer-Mikroskopie, insbesondere der Isolierung des Rückenmarks von Atembewegungsartefakte. Die Stabilität kann durch die Suche nach Bewegung des Rückenmarks unter einem Präpariermikroskop, die der Herzfrequenz oder Atem des Tieres entspricht beurteilen. Stabilität zu beurteilen ist sowohl während der Durchführung der Operation und auch unmittelbar vor Beginn der Bildgebung. Wenn der Animal nicht stabil ist, ist es angezeigt, die Platzierung und die Dichtheit der Rückenmark Klemmen erfolgen. Zelltyp-spezifische fluoreszierende Reportermausmodelle in Verbindung mit Knochenmark-Chimäre Ansätze haben die Identifizierung von monozytischen Zellen gegenüber Mikroglia und Axone erlaubt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Blut gewonnen Monozyten und Mikroglia sind nicht für die Sekundär axonalen Schäden nach Trauma mit Hilfe der hier 43 beschriebenen Methodik verantwortlich. Dextran konjugierten Schiff Farbstoff ermöglicht die Ermittlung von Schiffen sowohl Sehenswürdigkeiten zuleiten und Verletzungen der Gefäßintegrität zu identifizieren. Die Auswahl des geeigneten fluoreszierenden Reportermausmodell ist kritisch, damit die richtige Identifizierung der gewünschten Zelltypen, die abgebildet werden.

Entwicklung von Fluoreszenzmausmodelle, die für die Studien geeigneten unternommen sind auch entscheidend für den Erfolg von Experimenten. Die Unterscheidung zwischen den beiden Populationen von phagozytischen CX3CR1 + / GFP </sup> Zellen im ZNS ist traditionell schwierig. Wie hier gezeigt ist, kann eine gemeinsame immunologische Technik, Bestrahlung Chimären verwendet werden, um strahlungsresistent, ZNS-residenten Mikrogliazellen aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen unterscheiden. Die Bestrahlungsverfahren hat das Potenzial, die Blut-Hirn-Schranke schädigt, ändern Zellphänotypen, so Verwendung dieses Modells sollte sorgfältig geprüft werden. Das Ausmaß dieser Veränderungen unterscheidet sich mit Bestrahlungsdosis sowie Dauer der Erholungsphase, und ihre Auswirkungen auf verschiedene Entzündungsmodellen noch nicht vollständig untersucht. Die Wirkungen der Bestrahlung auf CNS Blut-Hirn-Schranke kann durch Abschirmung des Kopfes während der Bestrahlung zu minimieren, und dies hat sich gezeigt, dass die Zellinfiltration in das Rückenmark nach der Bestrahlung zu verringern, auch wenn das Rückenmark nicht direkt abgeschirmte 52. Hier haben wir beobachtet, dass die Anzahl von Zellen infiltriert in das ZNS im stationären Zustand als Ergebnis der Chimäre Generation unbedeutend ist im Gegensatz zu den taubener von Zellen in die Läsion. Andere alternative Modelle zu berücksichtigen sind Arzneimittel-induzierter Chimären 52 oder parabiotic Mausmodellen 53.

Hier haben wir eine bestimmte, einfache und reproduzierbare geringe Verletzungsmodell, das in einer Läsion an der dorsalen weißen Substanz des Rückenmarks, die einfach zu Bild unter Verwendung der 2-Photonen-Mikroskopie ist Ergebnisse präsentiert. Dieses Verfahren stellt auch einen messbaren Läsionen um den Grad der axonalen Sterben in der dorsalen Säulen, die in der Literatur mit komplementären festen Gewebeanalyse 16,18,43,48,54 gekoppelt testen. In diesem Modell, Tiere zeigen nur geringe Defizite und benötigen keine besondere Pflege nach der Verletzung. Zukünftige Studien unter Verwendung der hier beschriebenen dorsalen Säule Quetschverletzung und bildgebenden Verfahren können leistungsfähige Screening-Tools, um die Wirksamkeit der Behandlung von Rückenmarksverletzungen zu beurteilen. Diese Behandlungen können niedermolekularen Inhibitoren, Drogen, Zellprodukte, Gewebetransplantate und kombinatorische Behandlung schließens. Das Zusammenspiel von Makrophagen, Mikroglia und Neuronen sind wahrscheinlich auch eine Rolle bei anderen Krankheitsmodellen im Rückenmark, einschließlich multipler Sklerose, Tumoren, Meningitis und amyotrophe Lateralsklerose spielen, und diese Technik kann bei der Untersuchung dieser Erkrankungen sowie sein .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CX3CR1 GFP mice Jackson laboratories 5582
Thy-1 YFP H mice Jackson laboratories 3782
Mouse pie cage Braintree Scientific MPC 2 set
60mm2 petri dish Corning 430166 For bone marrow isolation
Falcon 40 um cell filter Fisher Scientific 08-771-1 For bone marrow isolation 
1x15mL and 1x50mL conical tube Fisher Scientific For bone marrow isolation
16 gauge needle BD 305177 For bone marrow isolation
1ml syringe BD 309628 For bone marrow isolation
ACK lysis buffer Gibco A10492-01 For bone marrow isolation
HBSS Gibco 1E+07 For bone marrow isolation
RPMI media Sigma R8758 For bone marrow isolation
F4/80 antibody Ebioscience 12-4801 PE For FACS verification of chimeras
30-gauge insulin syringe  BD 328280 For tail vein injection 
Spinal Cord Clamps Narshinge STS-A For imaging 
Ortho-Jet Dental Acrylic powder  Lang Dental REF1320 For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid Lang Dental REF1404 For imaging
Gelfoam gelatin sponges Pfizer 9E+06 For imaging
4-0 Ethilon sutures Ethilon 1667G For surgery
Reflex Clips, 7mm Kent Scientific INS750344 For surgery. Sterilize before use
Iris Scissors Fine Science Tools 14061-09 For surgery
45/5 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11251-35 For surgery
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 For surgery
30 gauge needle BD 305106 For making access holes in dura
Forceps Dumont #4 Biology tips Dumont 11242-40 For surgery
Needle Drivers Fine Science Tools 12002-12 For surgery
Michel Wound Clip Forceps Kent Scientific INS700753 For surgery
Wound clip remover Fine Science Tools 12033-00 For surgery
O-rings for Forceps Fine Science Tools 11200-00 For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately
Cordless Rechargable Animal trimmer Wahl Series 8900 for surgery
Vetbond 3M 1469SB For surgery
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08 For surgery
Nair Hair remover lotion Church & Dwight Co., Inc. NRSL-22329-05 For surgery
Isoflurane Butler Schein NDC 11695-6776-2 Drugs – for surgery
Marcaine Henry Schein 6E+06 Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously 
Bupernex Henry Schein 121-7793 Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg
aCSF Chemicals from Sigma 119 mm NaCl For surgery
26.2 mM NaHCO3 From Cold Spring Harbor Protocols
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucose 
TRITC-dextran 150,000 MW Sigma T1287 For intravenous administration to label vasculature
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References

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Intravital ImagingAxonal InteractionsMicrogliaMacrophagesMouseDorsal Column Crush InjurySpinal Cord InjuryTwo-photon MicroscopyBone Marrow ChimeraLaminectomy

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Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury. J. Vis. Exp. (93), e52228, doi:10.3791/52228 (2014).
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