Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
La reazione infiammatoria alla malattia o lesioni del sistema nervoso centrale (CNS) è scarsamente compreso, soprattutto per quanto riguarda le interazioni tra cellule immunitarie e residenti nel tessuto. Ricerche di queste interazioni cellulari nel midollo spinale sono di particolare interesse per l'animale vivente. Il tratto sostanza bianca solo facilmente accessibile SNC è nelle colonne dorsali del midollo spinale, rendendo questo un settore importante su cui concentrare gli sforzi sul miglioramento approccio sperimentale fattibile. Queste indagini sono state limitate a causa della difficoltà tecnica di accesso e stabilizzare il CNS per l'imaging. L'imaging dal vivo nel midollo spinale è stato descritto il movimento cellulare precedentemente 1-13, però, pochi studi hanno affrontato in una lesione del midollo spinale al di là di un paio d'ore dopo l'insulto iniziale. La lesione del midollo spinale traumatica è un ambiente complesso, con i neuroni, astrociti, fibroblasti, cellule progenitrici NG2, e cellule immunitarie Including microglia, neutrofili, macrofagi, cellule T, le cellule B e le cellule dendritiche 14,15. I macrofagi sono il sottoinsieme di cellule immunitarie responsabili fagocitosi nella lesione, infiltrazione dalla circolazione. Il ruolo di queste cellule fagocitiche è stato dibattuto, con rapporti che indicano che queste cellule possono assumere entrambi i ruoli dannosi e di protezione del tessuto danneggiato. Questi ruoli vanno dalla crescente moria assonale secondaria dopo un infortunio e di agire in modo fagocitaria 16-22, ad assumere una ferita guarigione fenotipo e diminuendo deficit funzionali in animali feriti 21,23,24.
In precedenza, i tentativi di distinguere macrofagi dalla microglia hanno fatto affidamento soprattutto sulla morfologia in tessuto sano. Tuttavia, microglia e macrofagi attivati esprimono molti degli stessi marcatori e visualizzano morfologia indistinguibili dopo la lesione 25-29, rendendo la separazione delle diverse attività di queste cellule difficili da studiare based a soli 30 questi fattori. Queste cellule possono essere separati mediante espressione differenziale di CD45 usando citometria a flusso 33,34, anche se questo approccio è meno utile nel discriminare questi tipi di cellule in vivo. Espressione differenziale Utilizzando di CCR2 e CX3CR1 in microglia e macrofagi è stato esplorato, anche se i cambiamenti dinamici nella espressione di questi marcatori come monociti differenziano in macrofagi possono complicare l'analisi accurata 35,36. Microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale e derivano da progenitori sacco vitellino durante lo sviluppo fetale, mentre i macrofagi sono derivati da progenitori del midollo osseo ed entrano nel sistema nervoso centrale feriti dopo un insulto 31,32. Un approccio alternativo all'utilizzo morfologia distinguere questi due tipi di cellule è quello di sostituire il midollo osseo con progenitori da un donatore che esprime un marcatore rintracciabile nei macrofagi derivati da progenitori donatori, preservando il residente CNS, recipiente-derivati microglia. Questi modelli chimerici midollo osseo sono comunemente utilizzati in molte altre applicazioni 37-40. Questo metodo ha avvertimenti unici associati con danni alla integrità della barriera ematoencefalica causata da irradiazione o farmaci citotossici utilizzati per l'eradicazione progenitori midollari nell'ospite, limitando così il suo impiego in alcune applicazioni. Recentemente, le distinzioni funzionali tra microglia e macrofagi nel sistema nervoso centrale stanno cominciando a discernere mediante citometria a flusso, analisi serie gene chip e metodi chimerismo 24,26,41-44, che si dimostrerà molto utile in futuro. Anche se la separazione di questi due tipi di cellule rimane difficile, comprendere le loro funzioni uniche è importante nel condurre a trattamenti più mirati di disturbi che coinvolgono sia microglia e macrofagi all'interno del sistema nervoso centrale.
Descrizione di interazioni cellulari all'interno della lesione del midollo spinale è venuto soprattutto da studi che coinvolgono modelli di coltura cellulare. Questo è due alle sfide coinvolti con immagini sia la lesione del midollo spinale e le cellule immunitarie insieme in un animale vivo. Modelli di roditori attuali di lesioni del midollo spinale di varia tipologia e la gravità includono modelli contusione 45,46, lesioni pin-prick 2, lacerazione 47, e la dorsale lesioni della colonna schiacciamento qui 16,18,48 descritto. L'infiammazione delle meningi aumenta con la gravità del danno e pone sfide uniche per l'impianto di finestre o interventi chirurgici per l'imaging di serie. Alcune di queste sfide includono l'infiltrazione di cellule fagocitiche nonché la generazione di tessuto fibroso sul sito chirurgico. Alcuni di questi problemi possono essere superati con la creazione di lesioni più piccole e che copre il midollo spinale esposta con medicazione chirurgica non-immunogenico tra la dura e muscoli paraspinali per consentire la successiva chirurgia riapertura, come avviene qui a studiare la dorsale della colonna lesione da schiacciamento . La capacità di immagine solo la parte dorsale del centrifugaal cavo limita anche la scelta di lesioni, in quanto modelli contusione provocano soprattutto danni al cavo centrale, spesso risparmiando la parte più dorsale delle colonne dorsali, soprattutto in momenti iniziali dopo l'infortunio 45,49. Pertanto, si descrive un modello di lesione semplice che produce un, ripetibile, lesione di forma rettangolare pulito che è utile sia per l'osservazione di movimento cella all'interno della lesione e per una facile quantificazione della posizione assonale rispetto alla lesione.
Interazioni Imaging di diversi tipi di cellule nei loro compartimenti nativi durante conseguente patologia in tempo reale ha generato grande interesse. All'interno della rete densa del CNS, contatto cellula-cellula e di segnalazione con celle adiacenti sono essenziali per la funzione normale e per comprendere CNS patologia. Qui, abbiamo descritto l'uso di 2-photon microscopia a scansione laser per l'osservazione di movimento cellulari all'interno di una lesione meccanica nel midollo spinale. Oltre alla qualità della chirurgia e tessuti di preparazione, la stabilità meccanica del tessuto è fondamentale per il successo microscopia time-lapse, soprattutto l'isolamento del midollo spinale di respirare artefatti da movimento. Stabilità può essere valutata, cercando per il movimento del midollo spinale sotto un microscopio da dissezione che corrisponde alla frequenza cardiaca o respiratoria dell'animale. Di stabilità deve essere valutata sia durante l'esecuzione dell'intervento e anche immediatamente prima di iniziare l'imaging. Se l'animal non è stabile, è opportuno adeguare al collocamento e la tenuta dei morsetti del midollo spinale. Cell-tipo modelli specifici fluorescente topo giornalista accoppiato con approcci chimera midollo osseo hanno permesso l'identificazione di cellule monocitiche contro microglia e assoni. Studi precedenti hanno rivelato che sangue derivate monociti e non microglia sono responsabili di danno assonale secondaria dopo un trauma con la metodologia descritta qui 43. Dextran coniugato tintura nave permette di identificazione della nave, sia per fornire punti di riferimento e di rilevare le infrazioni in integrità nave. La scelta del modello di topo reporter fluorescente appropriata è fondamentale per consentire la corretta identificazione dei tipi di cellule desiderati da acquisire.
Sviluppo di modelli fluorescenti mouse che sono appropriati per gli studi intrapresi è anche fondamentale per il successo degli esperimenti. Distinguere tra le due popolazioni fagocitici di CX3CR1 + / GFP </sup> Cellule del SNC è tradizionalmente difficile. Come mostrato qui, una tecnica immunologica comune, chimere irradiazione, può essere utilizzata per distinguere radio-resistenti, microglia CNS residente dai macrofagi del midollo osseo. La procedura di irradiazione ha il potenziale di danneggiare la barriera emato-encefalica e alterare fenotipi cellulari, quindi l'uso di questo modello dovrebbe essere considerato con attenzione. L'entità di tali variazioni differisce con la dose di irradiazione e la durata del periodo di recupero, e il loro impatto su diversi modelli infiammatori non è stato completamente studiati. Gli effetti di irradiazione sulla CNS barriera ematoencefalica possono essere minimizzati schermatura testa durante l'irraggiamento, e questo ha dimostrato di diminuire l'infiltrazione di cellule nel midollo spinale dopo irradiazione, anche se il midollo spinale non è direttamente schermato 52. Qui abbiamo osservato che il numero di cellule infiltranti nel SNC allo stato stazionario a seguito della generazione di chimera è insignificante in contrasto con la insensibileer di cellule che entrano lesione. Altri modelli alternativi da prendere in considerazione sono indotte da farmaci chimere 52 o modelli parabiotic topo 53.
Qui, abbiamo presentato un modello di lesione piccola specifico, semplice e riproducibile che si traduce in una lesione alla materia bianca dorsale del midollo spinale che è facile da un'immagine utilizzando la microscopia a 2 fotoni. Questo metodo fornisce anche una lesione quantificabile per saggiare il grado di deperimento assonale nelle colonne dorsali che in letteratura è stato accoppiato con complementare tessuto fissato analisi 16,18,43,48,54. In questo modello, gli animali mostrano solo deficit minimi e non richiedono cure particolari dopo l'infortunio. Futuri studi che utilizzano le lesioni della colonna cotta e di imaging tecniche dorsali qui descritte possono essere potenti strumenti di screening per valutare l'efficacia del trattamento per le lesioni del midollo spinale. Questi trattamenti possono includere piccoli inibitori molecolari, farmaci, prodotti cellulari, innesti di tessuto e trattamento combinatorias. L'interazione tra macrofagi, microglia e neuroni sono anche suscettibili di svolgere un ruolo in altri modelli di malattia del midollo spinale, tra cui la sclerosi multipla, tumori, la meningite e la sclerosi laterale amiotrofica, e questa tecnica può essere utile per lo studio di queste malattie, nonché .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |