Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
Den inflammatoriske reaktion på sygdom eller skade i centralnervesystemet (CNS) er dårligt forstået, især med hensyn til vekselvirkninger mellem immun- og residente celler i vævet. Undersøgelser af disse cellulære interaktioner i rygmarven er af særlig interesse i det levende dyr. Den eneste lettilgængelige CNS hvid substans-tarmkanalen er i den dorsale kolonner i rygmarven, hvilket gør dette et vigtigt område, som at koncentrere indsatsen om at forbedre mulig eksperimentel tilgang. Disse undersøgelser har været begrænset på grund af tekniske vanskeligheder ved at få adgang til og stabilisere CNS til billeddannelse. Levende billeddannelse i rygmarven er blevet beskrevet tidligere 1-13 dog få studier har behandlet cellulær bevægelse i en rygmarvsskade over et par timer efter den første fornærmelse. Den traumatiske rygmarv læsion er et komplekst miljø, med neuroner, astrocytter, fibroblaster, NG2 progenitorceller og immunceller including microglia, neutrofiler, makrofager, T-celler, B-celler og dendritiske celler 14,15. Makrofager er undergruppen af immunceller, der er ansvarlige for fagocytose i læsionen, infiltrerer fra kredsløbet. Den rolle, som disse fagocytceller er blevet drøftet, med rapporter om, at disse celler kan tage på begge skadelige og beskyttende roller i det beskadigede væv. Disse roller spænder fra stigende sekundær axonal skovdød efter en skade, og handler på en fagocytisk måde 16-22, at tage på en sårhelende fænotype og faldende funktionelle mangler i den skadede dyr 21,23,24.
Tidligere forsøg på at skelne mellem makrofager fra mikroglia har påberåbt primært på morfologi i sundt væv. Men aktiverede mikroglia og makrofager udtrykker mange af de samme markører og vise skelnes morfologi efter skade 25-29, hvilket gør adskillelse af forskellige aktiviteter i disse celler vanskelige at studere based af disse faktorer alene 30. Disse celler kan adskilles ved differentiel ekspression af CD45 ved hjælp af flowcytometri 33,34, selv om denne fremgangsmåde er mindre anvendelige diskriminere disse celletyper in vivo. Utilizing differentiel ekspression af CCR2 og CX3CR1 i mikroglia og makrofager er også blevet undersøgt, men de dynamiske ændringer i ekspressionen af disse markører monocytter differentiere til makrofager kan komplicere nøjagtig analyse 35,36. Mikroglia er beboeren immunceller i CNS og udspringer fra blommesækken stamfædre under fosterudviklingen, mens makrofager stammer fra knoglemarv stamceller og indtaste den skadede CNS efter en fornærmelse 31,32. En alternativ metode til at bruge morfologi til at skelne disse to celletyper er at erstatte knoglemarv med stamceller fra en donor dyr udtrykker en sporbar markør i makrofager afledt fra donor stamceller samtidig med at den CNS bosiddende, Recipient afledt mikroglia. Disse knoglemarv kimære modeller er almindeligt anvendt i mange andre applikationer 37-40. Denne metode har unikke forbehold forbundet med skader integriteten af blod-hjerne-barrieren forårsaget af bestråling eller cytotoksiske lægemidler, der anvendes til at udrydde marv progenitorer i værten, og dermed begrænse dets anvendelse i visse anvendelser. For nylig er funktionelle forskelle mellem mikroglia og makrofager i CNS begynder at skelnes ved hjælp af flowcytometri gen chip array analyse og kimærisme metoder 24,26,41-44, som vil vise sig meget nyttigt i fremtiden. Selv adskille disse to celletyper fortsat vanskeligt, at forstå deres unikke funktioner er en vigtig faktor for mere målrettede behandlinger af sygdomme, der involverer både mikroglia og makrofager i CNS.
Beskrivelse af cellulære interaktioner inden rygmarven læsion er primært kommet fra undersøgelser med cellekulturmodeller. Dette er due på problemstillingerne med billedbehandling både rygmarven læsion og immunceller sammen i et levende dyr. Aktuelle gnaver modeller af rygmarvsskade af varierende art og sværhedsgrad omfatter kontusion modeller 45,46, nålestiksaktioner skader 2, rifter 47 og den dorsale kolonne crush skade her 16,18,48 beskrevet. Betændelse i hjernehinden stiger med sværhedsgraden af skade og udgør unikke udfordringer for implantation af vinduer eller operationer for seriel billeddannelse. Nogle af disse udfordringer omfatter infiltration af fagocytiske celler samt dannelsen af fibrøst væv over operationsstedet. Nogle af disse problemer kan overvindes ved at skabe mindre læsioner og dækker udsatte rygmarven med ikke-immunogen kirurgiske forbinding mellem dura og paraspinous muskler for at muliggøre efterfølgende genåbning kirurgi, som det er gjort her for at studere den dorsale søjle knusningsskade . Evnen til at afbilde kun den dorsale del af spinal ledningen begrænser også valget af skaden, da kontusion modeller primært forårsage skade på den centrale ledning, ofte skåne den mest dorsale del af den dorsale kolonner, især på tidlige tidspunkter efter skade 45,49. Derfor beskriver vi en simpel skade model, der giver en ren, gentagelig, rektangulært formet læsion, som er nyttig for både observation af cellebevægelse inden læsionen og let kvantificering af axonal position i forhold til læsionen.
Imaging interaktioner af forskellige celletyper i deres native vævsrum under efterfølgende patologi i realtid har genereret stor interesse. Inden for tæt net af CNS, kontakt celle-celle og signaler med tilstødende celler er afgørende for normal funktion og for at forstå CNS patologi. Her har vi beskrevet anvendelsen af 2-foton laser scanning mikroskopi til observation af cellulære bevægelse inden for en mekanisk læsion i rygmarven. Ud over kvaliteten af kirurgi og vævspræparat, mekanisk stabilitet af vævet er altafgørende for en vellykket time-lapse mikroskopi, især isolering af rygmarven fra vejrtrækning bevægelsesartifakt. Stabilitet kan vurderes ved at se bevægelsen af rygmarven for under et dissektionsmikroskop, der svarer til puls eller vejrtrækning i dyret. Stabilitet bør vurderes både mens de udfører operationen og også umiddelbart før du begynder billeddannelse. Hvis animal er ikke stabilt, burde foretages justeringer til placering og tæthed af rygmarven klemmer. Celletypespecifik fluorescerende reporter musemodeller kombineret med knoglemarv kimære tilgange har tilladt identifikationen af monocytceller versus mikroglia og axoner. Tidligere undersøgelser har afsløret, at blodafledte monocytter og ikke mikroglia er ansvarlige for sekundær axonal skade efter traumer anvendelse af metoden her 43 beskrevet. Dextran konjugeret fartøj farvestof muliggør identifikation fartøj både at give vartegn og kunne påvise brud på beholderen integritet. Udvælgelsen af det passende fluorescerende reporter musemodel er kritisk for at tillade en korrekt identifikation af de ønskede celletyper, der skal afbildes.
Udvikling af fluorescerende musemodeller, der er passende for de undersøgelser, der gennemføres, er også afgørende for succes af eksperimenter. At skelne mellem de to fagocytiske populationer af CX3CR1 + / GFP </sup> Celler i CNS har traditionelt været vanskelig. Som vist her, kan anvendes en fælles immunologisk teknik, bestråling kimærer, at skelne radio-resistente, CNS-resident mikroglia fra knoglemarv-afledte makrofager. Bestrålingen procedure har potentiale til at ødelægge blodhjernebarrieren og ændre cellefænotyper, så brug af denne model bør overvejes nøje. Omfanget af disse ændringer varierer med strålingsdosis samt varigheden af tilbagebetalingsperioden, og deres indvirkning på forskellige inflammatoriske modeller er ikke fuldt undersøgt. Virkningerne af bestråling på CNS blodhjernebarrieren kan minimeres ved afskærmning hovedet under bestråling, og det har vist sig at nedsætte celleinfiltration i rygmarven efter bestråling, selvom rygmarven ikke direkte afskærmet 52. Her har vi iagttaget, at antallet af celler infiltrerer ind i CNS ved steady state som følge af kimær generation er ubetydelig i modsætning til følelsesløsER af celler ind i læsionen. Andre alternative modeller til at overveje omfatter narkotikaforårsagede kimærer 52 eller parabiotic musemodeller 53.
Her har vi præsenteret en konkret, enkel og reproducerbar lille skade model, der resulterer i en læsion på den dorsale hvide substans i rygmarven, der er let at billedet ved hjælp af 2-foton mikroskopi. Denne fremgangsmåde tilvejebringer også en kvantificerbar læsion at analysere graden af axonal skovdød i den dorsale kolonner, der i litteraturen er blevet koblet med supplerende fast vævsanalyse 16,18,43,48,54. I denne model viser dyr kun minimale underskud og kræver ingen særlig behandling efter skade. Fremtidige forsøg med den dorsale kolonne crush skade og billeddannende teknikker, der beskrives her, kan være effektive screening-værktøjer til at vurdere effekten af behandling for rygmarvsskade. Disse behandlinger kan omfatte småmolekylære inhibitorer, lægemidler, celleprodukter, vævstransplantater og kombinatorisk behandlings. Samspillet mellem makrofager, mikroglia og neuroner sandsynligvis også spille en rolle i andre sygdomstilstande modeller i rygmarven, herunder multipel sklerose, tumorer, meningitis og amyotrofisk lateral sklerose, og denne teknik kan være nyttig i undersøgelsen af disse sygdomme samt .
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |