Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.
Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.
在中枢神经系统(CNS)的炎性反应,疾病或损伤是知之甚少,特别是其中的组织内的免疫和固有细胞问候的相互作用。脊髓这些细胞相互作用的调查是在活的动物特别感兴趣。唯一方便CNS白质纤维束是在脊髓背列,这使得在其上注重提高可行的实验方法的努力的一个重要领域。这些研究已受到限制,由于在获得和稳定的中枢神经系统用于成像的技术难度。在脊髓实时成像已经在脊髓损伤了说明先前1-13,但是,很少有研究涉及蜂窝移动超出几个小时的初始损伤后。外伤性脊髓损伤是一个复杂的环境中,与神经元,星形胶质细胞,成纤维细胞,NG2祖细胞,免疫细胞包括第一卷纳克小胶质细胞,嗜中性粒细胞,巨噬细胞,T细胞,B细胞和树突状细胞14,15。巨噬细胞是免疫细胞负责吞噬在病变部位,从循环中浸润的所述子集。这些吞噬细胞的作用一直争论不休,有报告表明,这些细胞可以在受伤的组织既破坏和保护的作用。这些角色的范围从增加二次轴突顶梢枯死受伤后行动的吞噬方式16-22,采取对伤口愈合的表型和功能下降的赤字在受伤的动物21,23,24。
以前,试图区分的巨噬细胞从胶质已经主要依靠形态中的健康组织。然而,活化的小胶质细胞和巨噬细胞表达许多相同的标记和损伤后25-29显示区分形态,使这些细胞难以研究浅的不同活动的分离编辑这些因素仅30。这些细胞可通过CD45的使用流式细胞仪33,34的差异表达来分离,虽然这种方法是在体内鉴别这些细胞类型的有用。 CCR2和CX3CR1在小胶质细胞和巨噬细胞利用差异表达也得到了探索,虽然在这些标记为单核细胞表达的动态变化分化成巨噬细胞可复杂精确的分析35,36。小胶质细胞是驻地的免疫细胞在中枢神经系统和胎儿发育过程中产生于卵黄囊祖细胞,巨噬细胞的同时来源于骨髓祖细胞和侮辱31,32后进入中枢神经系统损伤。另一种方法使用形态来区分这两种类型的细胞,是从供体动物的替代骨髓祖细胞中表达来自供体祖细胞衍生的巨噬细胞一可追踪标记,同时保留在CNS驻地,RECIPient衍生的小胶质细胞。这些骨髓嵌合模型通常用在许多其他应用程序37-40。这种方法具有与损伤引起的用于消灭骨髓祖细胞在宿主,从而限制了其在某些应用中使用辐射或细胞毒性药物的血 – 脑屏障的完整性相关联的唯一的警告。最近,小胶质细胞和巨噬细胞在CNS之间的功能区别都开始通过使用流式细胞仪,基因芯片阵列分析和嵌合方法24,26,41-44,这将证明在将来非常有用的可分辨。虽然分离这两种类型的细胞仍然很难,了解其独特的功能,就是在通往涉及中枢神经系统中的小胶质细胞均和巨噬细胞疾病更有针对性的治疗非常重要。
脊髓病灶内细胞相互作用的描述已经主要来自包括细胞培养模型的研究。这为dUE向涉及成像两者脊髓损伤和免疫细胞一起在活体动物的挑战。不同类型和严重程度的脊髓损伤的电流啮齿动物模型包括挫伤模型45,46,针点刺受伤2,裂伤47,并在这里16,18,48描述的背柱破碎损伤。炎症在脑膜增加了与损伤的严重程度和构成窗户或手术用于串行成像的植入特有的挑战。其中的一些挑战包括吞噬细胞的浸润,以及纤维组织的生成在手术部位。其中的一些问题可以通过创建更小的病变和覆盖暴露的脊髓硬膜及脊柱旁的肌肉,以便随后重新开放手术间无免疫原性敷料被克服,因为在这里做研究背柱挤压伤。能力旋转图像只背部分人帘线也限制损伤的选择,因为挫伤模型主要造成损害中央线,损伤45,49后常常不放过背侧列的最背侧的一部分,尤其是在早期的时间点。因此,我们描述了能够产生一个干净的,可重复的,矩形形状的病变是两个内病变和位置相对于病变轴突的容易量化的观察小区移动的有用的简单损伤模型。
在其原生组织区室的不同类型的细胞中的实时随后的病理过程中成像的相互作用产生了极大的兴趣。内的密集网络的中枢神经系统,细胞 – 细胞接触,并与邻近的细胞信号传导对于正常功能和理解的CNS病理必不可少的。在这里,我们在脊髓中描述了使用2-光子激光扫描显微术的观测细胞运动的机械病灶内。除了手术和组织制剂的质量,组织的机械稳定性是最重要的成功时间推移显微镜,从呼吸运动伪影的脊髓特别的隔离。稳定性可通过对应于该动物的心脏速率或呼吸解剖显微镜下寻找脊髓运动进行评估。稳定应进行评估双方在执行了手术,也立刻开始前成像。如果灵魂升并不稳定,调整应使脊髓夹具的放置和密封性。加之骨髓嵌合体的方法的细胞类型特异性荧光报道小鼠模型允许单核细胞与小胶质细胞和轴突的识别。先前的研究已经表明,血液来源的单核细胞和小胶质细胞不负责使用此处43中描述的方法学创伤后继发性轴索损伤。葡聚糖共轭容器染料允许船只识别既提供地标,并确定血管的完整性破坏。合适的荧光报道小鼠模型的选择是至关重要的,以允许要被成像的正确识别所需的细胞类型。
荧光小鼠模型是适合于研究正进行开发也是以实验的成功是至关重要的。 CX3CR1 + / GFP的两个吞噬人群之间的区别</sup>细胞在中枢神经系统历来是困难的。如这里所示,一个常见的免疫学技术,照射嵌合体,可用于从骨髓衍生的巨噬细胞区分无线电抗性,中枢神经系统驻留小胶质细胞。照射过程具有破坏血脑屏障,并改变细胞的表型的潜力,所以使用该模型的应该仔细考虑。这些变化的程度不同,与辐射剂量以及恢复期的持续时间,以及它们对不同的炎症模型的影响还没有得到充分的研究。关于CNS血脑屏障照射的效果可以通过屏蔽照射期间的头被最小化,并且这已被证明是降低细胞浸润到脊髓在照射后,即使在脊髓不直接屏蔽52。在这里,我们已经观察到细胞浸润到CNS在稳态作为嵌合体产生的结果的数目而相比之下,麻木是微不足道呃进入病变细胞。其他替代模型考虑的因素包括药物引起的嵌合体52或联体小鼠模型53。
这里,我们已经提出了一个具体的,简单的和可重现的小损伤模型,结果在一个损伤脊髓的背侧白质,很容易使用双光子显微镜图像。这种方法还提供了一个可量化的病变以测定轴突顶梢枯死的,在所述文献中已加上的互补固定的组织分析16,18,43,48,54背侧列的程度。在该模型中,动物仅显示最小缺陷,不需要特别小心损伤后。利用这里所描述的背柱破碎损伤和成像技术未来的研究可以是有力的筛选工具,以评估治疗对脊髓损伤的疗效。这些处理可以包括小分子抑制剂,药物,细胞产品,组织移植物和组合治疗秒。巨噬细胞,小胶质细胞和神经元之间的相互作用也可能起到在脊髓其他疾病模型,包括多发性硬化,肿瘤,脑膜炎和肌萎缩性侧索硬化的作用,并且该技术可在这些疾病的研究是有用的,以及。
The authors have nothing to disclose.
The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick’s Foundation (A.Y.H.), Alex’s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle’s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
60mm2 petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
Falcon 40 um cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
1x15mL and 1x50mL conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
16 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
1ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
HBSS | Gibco | 1E+07 | For bone marrow isolation |
RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
30-gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9E+06 | For imaging |
4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
Reflex Clips, 7mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
Marcaine | Henry Schein | 6E+06 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mm NaCl | For surgery |
26.2 mM NaHCO3 | From Cold Spring Harbor Protocols | ||
2.5 mM KCl | |||
1 mM NaH2PO4 | |||
1.3 mM MgCl2 | |||
10 mM glucose | |||
TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |