Summary

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

Die Gentherapie, verwendet werden, um die funktionelle Erholung von Innenohrschwerhörigkeit zu erreichen, verspricht besseres Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und genetischen Mechanismen, die zu Gehörverlust zur Folge gewähren. Einführung von Vektoren in das Innenohr sind in einer Weise, die weit verteilt das Agens durch die Cochlea und minimiert eine Schädigung der bestehenden Strukturen erfolgen. Diese Handschrift beschreibt eine postOhr chirurgischen Ansatz, der für Maus Cochlea-Therapie mit molekular, pharmakologischen und virale Lieferung an Mäusen postnatalen Tag 10 Jahren über die Rundfenstermembran (RWM) verwendet werden kann. Diese chirurgischen Ansatz ermöglicht die schnelle und direkte Lieferung in die Scala tympani und minimiert den Blutverlust und die Vermeidung von Tiersterblichkeit. Diese Technik beinhaltet vernachlässigbare oder keine Schäden an wesentlichen Strukturen des inneren und des Mittelohres und Nackenmuskulatur, während hundert Erhaltung Anhörung. Um die Wirksamkeit dieser chirurgischen Technik wird der vesikulären glutam demonstrierenaß transporter 3 Knockout (VGLUT3 KO) Mäusen wird als ein Beispiel von einem Mausmodell für angeborene Taubheit, die Erholungsfähigkeit nach Abgabe VGLUT3 zum inneren Ohres unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV-1) verwendet werden.

Introduction

Die Gentherapie ist seit langem als mögliche Behandlung für genetische Schwerhörigkeit vorgeschlagen worden, aber der Erfolg in diesem Bereich schwer zu 1 blieb. Bisher wurden viral vermittelten Methoden aufgrund der theoretischen Möglichkeit, bestimmte Zelltypen innerhalb des relativ unzugänglich Cochlea gezielt überwogen. Beide Adenovirus (AV) und Adeno-assoziierten Virus (AAV) wurden für Cochlea-Genübertragung verwendet. AAVs sind vorteilhaft in der Cochlea für eine Reihe von Gründen. Sie sind replikationsdefizienten Viren und effizient transgenen Moleküle zu übertragen, um verschiedene Zelltypen, einschließlich Neuronen, ein wichtiges Ziel für eine Reihe von Ursachen für Hörverlust. AAV Eintritt in die Zelle durch spezifische Rezeptoren vermittelt 2; Somit muss die Wahl eines bestimmten Serotyps kompatibel sein mit den Zelltypen zu transduzieren. AAVs effektiv transfizieren Haarzellen 3 und enthalten in das Wirtsgenom, was zu einer stabilen, langfristige Expression des transgenic Protein und phänotypische Veränderungen in der Zelle 4. Obwohl nicht unbedingt für kurzfristige Anwendungen wie Haarzellenregeneration vorteilhaft, eine langfristige Expression für stabile Rettung von genetischen Defekten sehr wichtig. Da AAVs sind nicht mit einem menschlichen Krankheit oder Infektion assoziiert und zeigen keine Ototoxizität 5,6,7, sind sie ein idealer Kandidat für den Einsatz in der Gentherapie für vererbte Formen von Hörverlust 8.

Transfer von exogenem genetischen Material in den Säugetierinnenohr mittels viraler Vektoren ist im letzten Jahrzehnt untersucht und ist als vielversprechende Methode zur Behandlung von sowohl genetische und erworbene Formen von Hörverlust 9 entstehen. Die Cochlea ist potentiell ein ideales Ziel für die Gentherapie aus mehreren Gründen: 1) seines kleinen Volumens eine begrenzte Menge des Virus notwendig erfordert; 2) ihre relative Isolierung von anderen Organsystemen Grenzen Nebenwirkungen; und 3) ihre fluidgefüllten Kammern erleichtern viralenLieferung in ganz Labyrinth 10, 11,12,13,14, 15.

Mausmodelle für angeborene Taubheit ermöglichen den Einsatz von vielen Methoden der Untersuchung der Entwicklung des Innenohrs in einem systematischen, replizierbar Weise überwachen. Während die geringe Größe der Maus cochleae nicht präsentieren einige chirurgische Schwierigkeit dient die Maus als ein äußerst wichtiges Modell in der Studie der genetischen Hörverlust, mit mehreren experimentellen Vorteile gegenüber anderen Arten 16. Mausmodelle ermöglichen Einschätzung einer Reihe von Eigenschaften durch genetische Kopplungsanalyse, Sammlung von detaillierten morphologischen Beobachtungen und Simulation pathogenen Szenarien; als solche sind sie gute Kandidaten für die viral vermittelten Gentherapie. Umfangreiche genetische Studien an Mäusen in Kombination mit technologischen Fortschritte haben es möglich gemacht, gentechnisch veränderten Mäusen reproduzierbar über Labors 17,18, 19, 20,21 erzeugt. Furthermore, gibt es zahlreiche Modelle für sowohl erworbene und vererbte Schwerhörigkeit Phänotypen bei Mäusen, so dass strenge Tests in diesem Tiermodell 22, 23,24. So korrigieren Anhörung mit viral vermittelten Gentherapie in einem Mausmodell ist eine geeignete erste Schritt bei der Suche nach einem Heilmittel für Erkrankungen des Menschen.

Wir haben bereits gezeigt, dass transgene Mäuse, denen vesikulären Glutamattransporter 3 (VGLUT3) werden taub geboren wegen des Mangels an Glutamatfreisetzung an der IHC Bandsynapse 25. Da diese Mutation nicht auf eine Primär Degeneration der Haarsinneszellen führen, sind diese mutierten Mäusen möglicherweise ein ausgezeichnetes Modell, in der Cochlea Gentherapie für angeborene Hörverlust testen.

Bisher wurde eine Reihe von viralen Abgabetechniken für Cochlea Gentherapie beschrieben wurden, einschließlich runden Fenstermembran Diffusion runde Fenstermembran Injektion und Abgabe über einen Cochleostomie. Es gibt starkeial Vor- und Nachteile von jedem dieser Ansätze 9.

Hier berichten wir über eine chirurgische Methode für viral vermittelte Genübertragung auf die VGLUT3 KO Maus Innenohr durch die Rundfenstermembran (RWM). Die Post-Ohr RWM-Einspritzverfahren ist minimal-invasiv mit ausgezeichneten Anhörung Erhaltung und ist relativ schnell. Wie wir bereits veröffentlicht, in dem Bemühen, wiederhergestellt in diesem Mausmodell Gehör ein AAV1 Vektor, der das Gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) in die Cochlea dieser taub Mäusen am postnatalen Tag 12 eingeführt (P! @), Was die Wiederherstellung des Gehör 26. Anhörung im VGLUT3 KO-Mäusen wurde von akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) überprüft, während transgene Protein-Expression wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) überprüft. Diese Methodik somit zeigt, dass viral-vermittelte Gentherapie kann einen genetischen Defekt, die ansonsten Ergebnisse würden in Taubheit zu korrigieren.

Protocol

HINWEIS: Alle Verfahren und Behandlung der Tiere mit NIH Ethikrichtlinien und genehmigte Protokoll Anforderungen der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of California, San Francisco eingehalten werden. 1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie Führen Sie chirurgische Eingriffe an einem sauberen, gewidmet Raum. Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten, sterilisieren mit einer Glasperlen Sterilisator vor der Operation. HINWEIS: In diesem Prot…

Representative Results

Um die technischen Merkmale und die Nützlichkeit der Post-Ohrenansatz für Cochlea molekularen Therapie zu verifizieren, wurden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP und AAV2-GFP in P10-12 Mäuse Innenohr über die RWM geliefert. Dieser Ansatz zeigt erfolgreiche Expression des Transgens im inneren Haarzellen (IHC) (VGLUT3 Abbildung 1 und Abbildung 2 GFP und GFP 3A), äußeren Haarzellen (OHC) (GFP Abbildung 2) und Stützzellen (GFP Abbildung 2 und <st…

Discussion

In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Technik, die für Cochlea-Gentherapie eingesetzt werden können, mit dem Ziel der Wiederherstellung oder der Rettung normaler Gehörfunktion, die durch einen genetischen Defekt beeinträchtigt ist. Da es in der Regel atraumatisch ist, ist dieser Ansatz sicher für Cochlea-Gentransfer oder andere potenzielle molekulare Therapien 30. Andere Ansätze für Cochlea-Therapie beschrieben worden, einschließlich eines Bauchansatz 24, Cochleostomie 31,32<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

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Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

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