Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l'oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

La thérapie génique a longtemps été suggérée comme un traitement potentiel pour la perte auditive génétique, mais le succès dans ce domaine est resté inaccessible ^1. À ce jour, les méthodologies viralement médiation ont prédominé en raison de la capacité théorique de cibler des types cellulaires spécifiques dans la cochlée relativement inaccessible. Les deux adénovirus (AV) et le virus adéno-associé (AAV) ont été utilisés pour la livraison de gènes cochléaire. AAV sont avantageux dans la cochlée d'un certain nombre de raisons. Ils sont des virus à réplication déficiente et peuvent transférer efficacement molécules transgéniques pour différents types de cellules, y compris les neurones, une cible importante pour un certain nombre de causes de la perte auditive. AAV entrée dans la cellule est médiée par des récepteurs spécifiques ^2; Ainsi, le choix d'un serotype particulier doit être compatible avec les types de cellules à une transduction. AAV peut effectivement transfection de cellules de cheveux ³ et intégrer dans le génome de l'hôte, entraînant stable, expression à long terme de la transgenic protéines et le changement phénotypique dans la cellule ^4. Bien que pas nécessairement avantageux pour des applications à court terme tels que la régénération des cheveux-cellulaire, l'expression à long terme est très important pour le sauvetage stable de défauts génétiques. Parce que les AAV ne sont pas associés à une maladie humaine ou l'infection et ne démontrent aucune ototoxicité ^5,6,7, ils sont un candidat idéal pour une utilisation en thérapie génique pour les formes héréditaires de perte ^{de 8} entendre.

Transfert de matériel génétique exogène dans l'oreille interne des mammifères en utilisant des vecteurs viraux a été étudié au cours de la dernière décennie et est en train de devenir une technique prometteuse pour le traitement des formes à la fois génétiques et acquis de la perte auditive ^neuf. La cochlée est potentiellement une cible idéale pour la thérapie génique pour plusieurs raisons: 1) son petit volume nécessite un nombre limité de virus nécessaire; 2) son isolement relatif des autres effets des limites des systèmes d'organes secondaires; et 3) les chambres remplies de liquide faciliter viraleenvoi dans toute le labyrinthe ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Des modèles murins de la surdité congénitale permettent une utilisation de plusieurs méthodes d'étude pour suivre le développement de l'oreille interne d'une manière reproductible systématique. Alors que la petite taille de cochlée de souris ne présente une certaine difficulté chirurgicale, la souris sert un modèle extrêmement important dans l'étude de la perte auditive génétique, avec plusieurs avantages expérimentaux sur les autres espèces ^16. Des modèles de souris permettent d'évaluer un éventail de caractéristiques à travers l'analyse de liaison génétique, la collecte d'observations morphologiques détaillées, et la simulation de scénarios pathogènes; en tant que tels, ils sont de bons candidats pour la thérapie génique à médiation virale. De vastes études génétiques chez les souris combinées avec les avancées technologiques ont permis de générer des souris génétiquement modifiées de façon reproductible dans les laboratoires ^{17,18, 19, 20,21.} AILLEURSe, il existe de nombreux modèles à la fois pour acquises et héréditaires auditives phénotypes de perte chez la souris, ce qui permet des tests rigoureux dans ce modèle animal ^{22, 23,24.} Ainsi, la correction auditive en utilisant la thérapie génique virale médiation dans un modèle de souris est une première étape appropriée dans la recherche d'un remède pour la maladie humaine.

Nous avons précédemment montré que les souris transgéniques dépourvues de glutamate transporteur vésiculaire 3 (VGLUT3) naissent sourds en raison du manque de la libération de glutamate à l'IHC ruban synapse ^25. Étant donné que cette mutation ne conduit pas à une dégénérescence primaire des cellules ciliées sensorielles, ces souris mutantes sont potentiellement un excellent modèle pour tester dans laquelle la thérapie génique pour cochléaire surdité congénitale.

A ce jour, un certain nombre de techniques de délivrance viraux pour la thérapie génique cochléaire ont été décrites, y compris autour de diffusion de la membrane de fenêtre, l'injection de la membrane de fenêtre ronde et la livraison via une cochléostomie. Il ya puissanteial avantages et les inconvénients de chacune de ces approches ^neuf.

Nous rapportons ici une méthode chirurgicale pour la livraison de gènes à médiation virale de l'oreille interne VGLUT3 KO souris à travers la membrane de la fenêtre ronde (MLE). La méthode d'injection RWM post-auriculaire est peu invasive avec une excellente conservation de l'audience, et est relativement rapide. Comme nous l'avons déjà publié, dans un effort pour restaurer l'audition dans ce modèle de souris, un vecteur AAV1 portant le gène de VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) a été introduit dans la cochlée de ces souris sourds au jour postnatal 12 (P! @), Résultant en la restauration de l'audition ^26. Audience chez les souris KO VGLUT3 a été vérifiée par la réponse du tronc cérébral (ABR), tandis que l'expression de la protéine transgénique a été vérifiée par immunofluorescence (IF). Cette méthodologie démontre ainsi que la thérapie génique à médiation virale peut corriger un défaut génétique qui serait sinon résultats de la surdité.