Summary

Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

Published: June 19, 2013
doi:

Summary

Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.

Abstract

Исследования клеточных механизмов патогенеза патогенные дрожжи, такие как Candida Albicans, Histoplasma capsulatum и Cryptococcus neoformans обычно используют заражение хозяев-млекопитающих или клетки-хозяева (т.е. макрофаги) с последующим использованием дрожжей количественного анализа колониеобразующих единицы или проточной цитометрии. В то время как колониеобразующие единицы перечисление была наиболее широко используемый метод в данной области, этот метод имеет недостатки и ограничения, в том числе медленный рост некоторых видов грибов на твердой среде и низкой и / или переменной эффективности покрытие, которое представляет особый интерес при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов. Проточная цитометрия может обеспечить быстрое количественной информации о дрожжи жизнеспособности, однако, применение проточной цитометрии обнаружения патогенных дрожжей было ограничено по ряду практических причин, включая его высокой стоимости и биологической соображений. Здесь мы демонстрируем на основе образацитометрические методологии с использованием Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience ООО) для количественного определения жизнеспособных патогенных дрожжей в совместной культуре с макрофагами. Наши исследования направлены на выявление двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum колонизирует альвеолярных макрофагов путем репликации в макрофагах фагосома, и здесь, мы количественно оценить рост H. capsulatum дрожжей в RAW 264.7 макрофагами использованием акридиноранжа / пропидий йодида окрашивания в сочетании с изображения цитометрии. Наш метод точно повторяет тенденции роста как измеряется традиционными колониеобразующая единица перечисления, но со значительно более высокой чувствительностью. Кроме того, мы непосредственно оценить инфекции живых макрофагов с GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. Наша методика предлагает быстрое, точное и экономичное средство для обнаружения и количественного определения важных человеческих патогенных грибов в остроумии ассоциациич клетки хозяина.

Introduction

Исследования патогенных грибов в связи с их хозяев и / или клетки-хозяева, часто требуют количественного жизнеспособных клеток грибов за время курса или в других условиях инфекции. Перечень колониеобразующих единиц (КОЕ) представляет собой стандартный метод, посредством которого количество жизнеспособных клеток грибов были измерены, однако, этот метод имеет ряд недостатков и ограничений. Во-первых, многие виды грибов растут медленно. Рост видимые колонии на твердой среде может занять 1-2 недели, что значительно замедляет темпы научных исследований. Во-вторых, манипуляции образцов в процессе покрытия КОЕ это трудоемкий процесс, так как несколько разведения должны быть покрыты для обеспечения счетного числа колоний. В-третьих, количество КОЕ, как правило, ниже, чем количество жизнеспособных организмов покрытием, так как покрытие эффективность значительно ниже 100%. Например, покрытие для эффективности диморфными грибкового патогена Histoplasma capsulatum может быть выше, чем 90%, но обычно по цене от30% и даже ниже (10%) для соответствующих грибковых диморф Paracoccidioides Brasiliensis 1, 2. Покрытие эффективности Candida Albicans также подвержен изменчивости 3. Наконец, анализ КОЕ составляет только живых и активно делящиеся клетки, способные устанавливать роста на твердой среде, в то время как во многих ситуациях, было бы полезно, чтобы определить наличие и концентрацию мертвыми и / или метаболически неактивные клетки.

Ранее методов проточной цитометрии для количественного определения нескольких патогенных видов грибов были описаны 4-6. Однако из-за биобезопасности сдерживания проблемы при использовании уровня биобезопасности 2 (BSL2) или BSL3 уровня патогенов на общих цитометрах потока, принятие эта техника была ограничена. Как проточной цитометрии, изображения цитометрии является чувствительным и быстрый метод клеточной количественной оценке. Тем не менее, изображение цитометрии могут быть выполнены в часть стоимости с аналогичными результатами 7 –11. Здесь мы описываем методы для выполнения изображение цитометрии патогенных грибков в сочетании с клетками-хозяевами. Мы демонстрируем наши методы с использованием двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum является диморфными грибкового патогена, вызывающих респираторные заболевания, а в людях, он растет как начинающим дрожжей и повторяет в альвеолярных макрофагах Candida Albicans является человеком синантропных видов, которые иногда вызывает кандидоз.. Мы покажем, что изображения цитометрии позволяет быстрое количественное эти дрожжи, вместе с визуализацией возможности.

Protocol

1. Инфицирование макрофагов H. capsulatum, C. Albicans 16 часа до инфицирования, семена макрофагов при желаемой плотности в 24-луночных планшетах. В этом протоколе, плотность 3,0 х 10 5 клеток / лунка была использована. Добавить грибковые клетки в логарифмической фазе роста в желае?…

Representative Results

Мы использовали Cellometer цитометром изображения видения для контроля роста H. capsulatum в клетки макрофагов. RAW 264.7 клетки были инфицированы H. capsulatum дрожжевых клетках и в различные моменты времени, образцы подвергали AO / PI последующим окрашиванием на основе изображения цитометрии. Па…

Discussion

Изображение цитометрии позволяет пользователю захватить высокое качество изображения и, используя специализированное программное обеспечение, выполнить быстрое количественное клеток. Один потенциальный вызов принятием изображения цитометрии в области микробного патогенеза явля?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

REAGENTS
DMEM Life Technologies 11965-084
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000044
AO/PI Solution Nexcelom Bioscience CSK-0102
Disposable Counting Chamber Nexcelom Bioscience CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software Nexcelom Bioscience

References

  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Play Video

Cite This Article
Berkes, C., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells. J. Vis. Exp. (76), e50599, doi:10.3791/50599 (2013).

View Video