숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용
Summary
여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 문화 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 CFU 열거에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
이러한 칸디다 알비 칸스, Histoplasma capsulatum, 그리고 크립토 neoformans를 같은 병원성 효모의 세포 발병 메커니즘의 연구는 일반적으로 단위 분석이나 유동 세포 계측법을 형성 식민지을 사용하여 효모 정량 뒤에 포유류의 호스트 또는 호스트 세포 (즉, 대 식세포)의 감염을 사용합니다. 콜로니 형성 단위 열거 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 방법 왔지만,이 기술은 성장을 비교할 때 특별한 관심입니다 고체 미디어 및 저 및 / 또는 변수 도금 효율에 약간의 곰팡이 종의 성장 둔화 등 단점과 한계를 가지고 야생형과 돌연변이 균주. 유동 세포 계측법 효모의 생존에 대한 신속한 정량 정보를 제공 할 수 있습니다, 그러나, 병원성 효모에 대한 유세포 검출 채택 높은 비용과 바이오 안전성 고려 등 실제적인 이유로 제한되었습니다. 여기에서, 우리는 이미지 기반을 보여대식 세포와 공동 배양 가능한 병원성 효모의 정량 Cellometer 비전 (생명 Nexcelom, LLC)를 사용하여 유세포 방법. Histoplasma capsulatum과 칸디다 H. :. 우리의 연구는 두 가지 인간의 곰팡이 병원균의 검출에 초점을 capsulatum는 대식 세포 phagosome에 내 복제하여 폐포 대 식세포를 정착, 그리고 여기, 우리는 양적 H.의 성장을 평가 이미지 세포 계측법과 함께 크리 딘 오렌지 /의 propidium 요오드 염색을 사용하여 RAW 264.7 대 식세포에서 capsulatum 효모. 우리의 방법 충실 단위 열거 형을 형성하는 전통적인 식민지로 측정 recapitulates 성장 동향,하지만 크게 증가 감도. 또한, 우리가 직접 C.의 GFP 발현 균주 라이브 대식 세포의 감염을 평가 알비 칸스. 우리의 방법론은 협회의 재치있는 중요한 인간의 곰팡이 병원균의 검출 및 정량화, 신속 정확하고 경제적 인 방법을 제공합니다H 호스트 세포.
Introduction
자신의 호스트 및 / 또는 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 연구는 종종 시간 과정을 통해 또는 다른 감염 조건 하에서 가능한 진균 세포의 정량화가 필요합니다. 집락 열거 형 (CFU)이 가능한 진균 세포의 수를 측정 한하는 표준 방법입니다, 그러나,이 방법은 몇 가지 단점과 한계가있다. 첫째, 많은 곰팡이 종은 천천히 성장하고있다. 고체 매체에 표시 식민지의 성장은 크게 연구의 속도를 둔화, 1-3 주 소요될 수 있습니다. 여러 희석은 식민지의 셀 수있는 숫자를 보장하기 위해 도금해야하기 때문에 둘째, CFU 도금 동안 시료의 조작은, 힘든 과정입니다. 도금 효율은 물론 100 % 이하이기 때문에 셋째, CFU의 수는 도금 가능한 유기체의 수보다 일반적으로 낮다. 예를 들어, 동종 이형의 진균 병원체 Histoplasma capsulatum에 대한 도금 효율은 90 %로 높은 수 있지만, 같은 일상적으로 낮은 수30 %는 관련 곰팡이 dimorph의 Paracoccidioides의의 brasiliensis 1, 2 (10 %)도 낮다. 칸디다 albicans에 대한 도금 효율도 변화 3에 따라 달라질 수 있습니다. 많은 경우에, 그것은 죽은 및 / 또는 대사 비활성 셀의 존재와 농도를 결정하는 것이 유용 할 것이다 반면 마지막으로, CFU 분석은 고체 매체에 성장을 수립 할 수있는 유일한 라이브 적극적으로 나누어 세포를 차지하고 있습니다.
이전에 여러 가지 병원성 진균의 정량화를위한 유세포 방법은 4-6에 설명되어 있습니다. 그러나 공유 흐름 cytometers에 바이오 안전성 수준 2 (BSL2) 또는 BSL3 수준의 병원체를 사용하여 관련 바이오 안전성 봉쇄 문제로 인해,이 기술의 채택이 제한되었습니다. 유동 세포 계측법 마찬가지로, 이미지 세포 계측법 세포 정량의 민감하고 빠른 방법입니다. 그러나 이미지 세포 계측법은 비교 결과 7 적은 비용으로 수행 할 수 있습니다 –11. 여기, 우리는 호스트 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 이미지 세포 계측법을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 두 사람의 곰팡이 병원균을 사용하여 우리의 방법을 보여줍니다 Histoplasma capsulatum 및 칸디다 균 albicans를 H.. capsulatum는 호흡기 질환을 일으키는 동종 이형의 진균 병원체, 인간, 그것은 같은 신진 효모 성장하고 폐포 대 식세포 내에서 복제 칸디다 때때로 칸디다증을 일으키는 인간의 공생 종입니다.. 우리는 이미지 세포 계측법 시각화 기능과 함께,이 효모의 빠른 정량화 할 수 있는지 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이미지 세포 계측법은 사용자가 고품질 이미지를 캡처 전문 소프트웨어를 사용하여 세포의 빠른 정량화를 수행 할 수 있습니다. 미생물 병인의 분야에있는 이미지 세포 계측법의 채택에 하나의 잠재적 인 문제는 계산되는 미생물 포유류 숙주 세포를 포함한 세포의 혼합 인구에 존재하는 것입니다. 여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 체외 대식 세포 감염시 가능한 병원성 효모?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
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