استخدام الخلوي على الصورة لعرض الكمي من الفطريات الممرضة في جمعية مع الخلايا المضيفة
Summary
هنا، علينا أن نظهر كيف الخلوي صورة يمكن استخدامها لتقدير حجم الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة في الثقافة. هذه التقنية يمكن استخدامها كبديل للتعداد كفو.
Abstract
دراسات الآليات المرضية الخلوية من الخمائر المسببة للأمراض مثل المبيضات البيض، المغمدة المغمدة، والمستخفية المورمة عادة توظف إصابة الجنود الثدييات أو الخلايا المضيفة (أي الضامة) تليها الكمي باستخدام الخميرة مستعمرة تشكيل وحدة التحليل أو التدفق الخلوي. في حين كانت مستعمرة تشكيل وحدة التعداد الأسلوب الأكثر استخداما في هذا المجال، هذا الأسلوب له عيوب وأوجه القصور، بما في ذلك النمو البطيء لبعض الأنواع الفطرية على وسائل الاعلام الصلبة والكفاءة الطلاء منخفض و / أو المتغير، والذي هو مصدر قلق خاص عند مقارنة النمو من السلالات البرية من نوع ومتحولة. يمكن التدفق الخلوي توفير معلومات كمية سريع بشأن جدوى الخميرة، ومع ذلك، اعتماد تدفق cytometric الكشف عن الخمائر المسببة للأمراض كان محدودا لعدد من الأسباب العملية بما في ذلك تكاليف عالية واعتبارات السلامة الأحيائية. هنا، علينا أن نبرهن على الصورة القائمة علىمنهجية cytometric باستخدام الرؤية Cellometer (Nexcelom العلوم البيولوجية، LLC) لتقدير حجم الخمائر المسببة للأمراض قابلة للحياة في الثقافة المشتركة مع الضامة. تركز دراساتنا على الكشف عن مسببات الأمراض الفطرية اثنين الإنسان: المغمدة النوسجة والمبيضات البيض H.. المغمدة يستعمر الضامة السنخية بواسطة تكرار داخل يبلوع بلعم، وهنا، ونحن كميا تقييم نمو H. الخمائر المغمدة في RAW 264.7 الضامة باستخدام أكريدين البرتقال / propidium تلطيخ يوديد في تركيبة مع صورة الخلوي. لدينا وسيلة بأمانة اتجاهات النمو يلخص مقاسا مستعمرة التقليدية تشكيل وحدة التعداد، ولكن مع زيادة كبيرة حساسية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم مباشرة إصابة الضامة العيش مع سلالة GFP، معربا عن من C. البيض. يقدم منهجية لدينا وسيلة سريعة ودقيقة، واقتصادية للكشف والقياس الكمي لمسببات الأمراض الفطرية الهامة الإنسان في جمعية الطرافةالخلايا المضيفة ح.
Introduction
وغالبا ما تتطلب دراسات من الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع مضيفيهم و / أو الخلايا المضيفة الكمي للخلايا قابلة للحياة الفطرية على دوام أو في ظل ظروف العدوى المختلفة. تعداد الوحدات تشكيل مستعمرة (كفو) هو الأسلوب المعيار الذي تم قياسه عدد الخلايا الفطرية قابلة للحياة، ولكن هذا الأسلوب له عيوب عدة والقيود. الأولى، العديد من الأنواع الفطرية هي بطيئة النمو. نمو المستعمرات مرئية على وسائل الاعلام الصلبة يمكن أن تأخذ 1-2 أسابيع، وتباطؤ ملحوظ وتيرة البحوث. الثانية، والتلاعب في عينات خلال كفو الطلاء هو عملية شاقة، حيث يجب أن يتم مطلي عدة التخفيفات لضمان وجود عدد معدود من المستعمرات. الثالث، وعدد من كفو أقل عادة من عدد من الكائنات قابلة للحياة مطلي لأن كفاءة الطلاء هو أقل بكثير من 100٪. على سبيل المثال، يمكن أن الكفاءة تصفيح لديمبرافيك الفطرية المغمدة النوسجة الممرض يكون مرتفعا كما 90٪، ولكن بشكل روتيني منخفضة مثل30٪ و هي أقل من (10٪) للذات صلة الفطرية dimorph نظيرة الكروانية البرازيلية 1، 2. كفاءة الطلاء عن المبيضات البيض هي أيضا عرضة للتقلب 3. وأخيرا، يمثل تحليل كفو للخلايا الحية فقط وتقسيم بنشاط قادرة على إنشاء النمو على وسائل الاعلام الصلبة، في حين، سيكون من المفيد في كثير من الحالات لتحديد وجود وتركيز من الخلايا الميتة غير نشط و / أو عملية الأيض.
سابقا، وقد وصفت وسائل تدفق cytometric لتقدير من العديد من الأنواع الفطرية المسببة 4-6. ولكن نظرا لاحتواء قضايا السلامة الأحيائية المشاركة مع استخدام مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2) أو مسببات الأمراض على مستوى BSL3 على أجهزة قياس التدفق الخلوي المشتركة، واعتماد هذا الأسلوب كانت محدودة. مثل التدفق الخلوي، الخلوي الصورة هي طريقة حساسة وسريعة الكمي الخلية. ومع ذلك، الخلوي صورة لا يمكن أن يؤديها في جزء صغير من التكلفة مع نتائج مماثلة 7 –11. هنا، نحن تصف الأساليب لأداء الخلوي صورة من الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة. علينا أن نظهر طرقنا باستخدام اثنين من مسببات الأمراض الفطرية الإنسان: المغمدة النوسجة والمبيضات البيض H.. المغمدة هو الممرض الفطرية ديمبرافيك التي تسبب أمراض الجهاز التنفسي؛ في البشر، وأنها تنمو الخميرة في مهدها كما ويعيد داخل الضامة السنخية المبيضات البيض هي الأنواع المتعايشة الإنسان التي تسبب أحيانا المبيضات. وتبين لنا أن صورة الخلوي يسمح الكمي السريع لهذه الخمائر، جنبا إلى جنب مع القدرة على التصور.
Protocol
Representative Results
Discussion
صورة الخلوي يسمح للمستخدم التقاط صور ذات جودة عالية و، وذلك باستخدام البرمجيات المتخصصة، نفذ الكمي السريع للخلايا. واحد تحديا محتملا لاعتماد الخلوي صورة في مجال الجراثيم المرضية هو أن الميكروبات لفرزها موجودة في يسكنها خليط من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المضيفة ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
