Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера
Summary
Существует растущий интерес в понимании иммунологических функций конкретной субпопуляции клеток в Пейеровы бляшки (PPS), первичные индуктивных участков кишечника связанных лимфоидной ткани. Здесь мы наметим параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии анализа и PP cryosections для иммунной окраски.
Abstract
Пейеровы бляшки (ПП) являются неотъемлемой частью кишечника, лимфоидной ткани (GALT) и играют центральную роль в кишечном иммунологического и гомеостаза. Частицы антигенов и микроорганизмов в просвете кишечника постоянно, отобранных PP клетки M в фолликул связанных эпителия (FAE) и транспортируется в основной сети дендритные клетки (ДК), макрофаги и лимфоциты. В этой статье мы опишем протоколы, в которых мышиные ПП являются: (I) распадается на одном суспензии клеток и подвергали проточной цитометрии и (II), подготовленный для cryosectioning и иммунной. Для проточной цитометрии, PPS механически диссоциированных и затем фильтруют через 70 мкм мембран для создания одного клеточные суспензии бесплатно эпителиальных клеток и крупного мусора. Начиная с 20-25 PPS (от четырех мышей), этот быстрый и воспроизводимый метод дает населению> 2,5 х 10 6 клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Для cryosectioning, свежиеют изолированным PPs погружены в оптимальной температуры резания (ОКТ) среды, оснастки замороженной в жидком азоте, а затем разрезе использования cryomicrotome. Срезы тканей (5-12 мкм), сушат на воздухе, фиксировали ацетоном или метанолом, а затем подвергают иммунного.
Introduction
Пейеровы бляшки (ПП) являются макроскопические агрегаты организованных лимфоидных фолликулов присутствует во всем тонком кишечнике людей и мышей (рис. 1) и составляют основные сайты, на которых слизистых иммунных ответов, возбужденное в отношении диетических антигенов, синантропных бактерий, патогенных микроорганизмов, а также пероральных вакцин 1-4. В отличие от других периферических лимфоидных тканей, таких как мезентериальных лимфатических узлов, PPS не хватает афферентные лимфатические сосуды. Таким образом, адаптивный иммунный ответ в PPs приводятся в ответ на антигены, полученные из просвета кишечника. Выборка просвета антигенов осуществляется по фолликула связанных эпителия (FAE), который состоит как из энтероцитов и антиген-отбор проб клеток, известных как М-клетки. Под FAE, в суб-эпителиальные купола (SED) области, лежит сети дендритные клетки (ДК) смешались с макрофагами, В-клетки и CD4 + Т-клетки 5-9. В основе каждой PP лимфоидной folliclе, фолликулярные дендритные клетки (ФСКН) и В-клеток, богатых центрального зародышевого центра, в окружении Т-клеток богатых зон интерфолликулярной. Антиген отбора образцов, ПП результатов в развитии IgA + В-клеток plasmablasts и CD4 +-эффекторов и клеток памяти, что семена окружающих ргорпа пластинки и обеспечивает иммунитет к широкому спектру к слизистой оболочке захватчиков.
Пройдя сложные события, связанные с иммунологической антиген выборки, обработки и представления в PPs является непростой задачей, учитывая, что PP клетки составляют лишь малую долю от общего лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишечника. Чтобы помочь в в пробирке характеристика клеток в этой среде, мы предоставляем протокол для подготовки общего мыши PP ячеек для проточной цитометрии и функционального анализа, а также протокол для подготовки PP cryosections для иммунофлуоресцентного микроскопии и immunohistology. Наш протокол для выделения, характеристика и иммуноокрашивания МоВэлектронной PP клеток не нова сама по себе, о чем свидетельствует тот факт, что имеются многочисленные ссылки насчитывает более 25 лет, что привести эти методы 5,6,9-11. Скорее всего, наш протокол обеспечивает обтекаемый (и визуальный) метод для следователей сбора PPs в первый раз. Методы мы опишем легко освоили и легко получить большое количество клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Cryosectioning протокол дает высокую воспроизводимость серийных срезов идеально подходит для окрашивания иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Кроме того, наш протокол дополняет два других недавних статей Юпитера. Во-первых, Фукуда и коллег, описывает использование лигированную подвздошной анализы цикла для оценки поглощения патогенных бактерий PP клетки M 12. Другой, Geem и коллег, описывает выделение и характеристика ДК и макрофагов мыши слизистой оболочки кишечника, но явно исключает ПП от их анализ 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы предоставили параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии и функционального анализа и cryosections для иммунной окраски. Оба метода являются высокая воспроизводимость и легко доступны, при условии, цитометра и криостат имею?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Renjie Song (Wadsworth центр проточной цитометрии Core) за помощь в анализе клеток и Хелен Джонсон (Wadsworth Центра животных Гистопатология Core) для приготовления парафиновых срезов. Мы благодарим д-р Ричард Э. Коул (Wadsworth Центра световой микроскопии Core) за помощь в конфокальной микроскопии и коллекции изображений. Мы хотели бы поблагодарить Энди Bentley (Wadsworth центр Фото и иллюстрации) за помощь с анимацией.
MDJ при поддержке Фонда исследований науки о жизни, Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) Fellowship. SA при поддержке Центра Wadsworth-Health Research Инк очной докторской стипендии. Эта работа была частично поддержана грантами NIH HD061916 и GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
