Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Placas de Peyer (PP) são agregados macroscópicos de organizados folículos linfóides presentes em todo o intestino delgado dos humanos e ratos (Figura 1) e que constituem os sítios primários em que mucosas respostas imunes são iniciadas contra antígenos alimentares, bactérias comensais, agentes patogénicos microbianos e vacinas orais ^1-4. Ao contrário de outros tecidos linfóides periféricos, como os linfonodos mesentéricos, PPs não têm vasos linfáticos aferentes. Como tal, as respostas imunes adaptativas em PPs são accionados em resposta a antigénios derivados a partir do lúmen intestinal. A amostragem de antigénios luminais é realizado pelo epitélio do folículo-associado (FAE), que consiste em dois enterócitos e antigénio-amostragem células conhecidas como células M. Abaixo da FAE, na cúpula sub-epitelial (SED) região, encontra-se uma rede de células dendríticas (CDs) misturavam-se com macrófagos, células B e células T CD4 ^{+ 5-9.} No centro de cada follicl PP linfóidee são células dendríticas foliculares (FDC) e uma de células B rico centro centro germinal, ladeada por zonas de célula T ricos interfoliculares. Amostragem de antigénio por PPs resulta no desenvolvimento de IgA + plasmablasts de células B e as células CD4 ⁺ efectoras e de memória que a semente da lâmina envolvente e proporcionar imunidade a uma grande variedade de invasores mucosas.

Dissecando os eventos imunológicos complexos associados à amostragem antígeno, tratamento e apresentação em PPC é uma tarefa difícil, considerando-se que as células PP constituem apenas uma pequena fração do total de células linfóides na mucosa intestinal. Para ajudar na caracterização in vitro de células neste meio, é proporcionado um protocolo para a preparação de células totais de PP de rato para a análise de citometria de fluxo e funcionais, bem como um protocolo para a preparação de PP criocortes para microscopia de imunofluorescência, e imunohistologia. O protocolo para o isolamento, caracterização e imunocoloração de mouscélulas E PP não é novidade, por si só, como evidenciado pelo fato de que há inúmeras referências datam mais de 25 anos que citam estas técnicas ^5,6,9-11. Em vez disso, nosso protocolo fornece um método (e visual) simplificado para investigadores coleta PPs pela primeira vez. As técnicas aqui descritos são facilmente dominado e prontamente produzir grandes números de células com> 90% de viabilidade celular. O protocolo cryosectioning rende altamente reprodutíveis de secções seriadas idealmente adequadas para a coloração de imunofluorescência e de imagem confocal. Além disso, o nosso protocolo complementa dois outros artigos de Jove recentes. O primeiro, por Fukuda e colaboradores, descreve a utilização de ensaios de ligadura de laço ileal para avaliar a absorção de bactérias patogénicas em células PP M ^12. O outro, pelo GEEM e colaboradores, descreve o isolamento e caracterização de DCs e macrófagos da mucosa intestinal do rato, mas exclui explicitamente PPs da sua análise ¹³.