וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine
Summary
יש התעניינות הולכת וגובר בהבנת הפונקציות החיסוניות של אוכלוסיות מסוימות של תאים בתיקונים של Peyer (PPS), אתרים אינדוקטיביים העיקריים של רקמות הלימפה מעיים כרוכות בכך. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לניתוח cytometric זרימה וcryosections PP לimmunostaining.
Abstract
הטלאים של Peyer (PPS) הם רכיבים בלתי נפרדים מרקמות הלימפה מעיים הקשורים (גאלט) ולשחק תפקיד מרכזי בimmunosurveillance והומאוסטזיס מעיים. אנטיגנים חלקיקים וחיידקים בחלל המעי נדגמים ברציפות על ידי תאי PP ז אפיתל זקיק המשויך (Fae) והועברו לרשת בסיסית של תאים דנדריטים (DCS), מקרופאגים ולימפוציטים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקולים בי PPS Murine הם (אני) ניתק להשעיות תא בודדות ונתון לcytometry הזרימה (ii) שהוכן עבור cryosectioning וimmunostaining. עבור cytometry זרימה, PPS הם מכאני ניתק ולאחר מכן מסונן דרך 70 מיקרומטר ממברנות ליצור השעיות תא בודדות ללא תאי אפיתל ופסולת גדולים. החל עם 20-25 PPS (מארבעה עכברים), שיטה מהירה ולשעתק זו מניבה אוכלוסייה> 2.5 x 10 6 תאים עם> 90% כדאיויות תא. לcryosectioning, טריPPS ly המבודד שקוע בטמפרטורה בינונית אופטימלי חיתוך (אוקטובר), Snap-קפוא בחנקן נוזלי, ולאחר מכן נותח באמצעות cryomicrotome. קטעי רקמה (5-12 מיקרומטר) הם אוויר יבשים, קבועים עם אצטון או מתנול, ולאחר מכן נתונים לimmunolabeling.
Introduction
הטלאים של Peyer (PPS) הם אגרגטים מאקרוסקופיות של זקיקי הלימפה מאורגנים נוכחיים לאורך המעי הדק של בני אדם ועכברים (איור 1), ומהווים את האתרים העיקריים שבו תגובה חיסונית ברירית הם יזמו נגד אנטיגנים תזונתיים, חיידקי commensal, פתוגנים של חיידקים, וחיסונים דרך פה 1-4. בניגוד לרקמות הלימפה היקפיות אחרות כגון הבלוטות הלימפה mesenteric, PPS חסר lymphatics הביא. כאמורות, תגובות חיסוניות בהסתגלות PPS מונעות בתגובה לאנטיגנים הנגזרים מלומן המעי. הדגימה של אנטיגנים luminal מושגת על ידי האפיתל זקיק המשויך (Fae), אשר מורכב משני enterocytes ותאי אנטיגן דגימה הידועים כתאי M. מתחת Fae, באזור הכיפה תת אפיתל (SED), נמצאת רשת של תאים דנדריטים (DCS) מתערבים עם מקרופאגים, תאי B, ותאי T מסוג CD4 + 5-9. במרכזו של כל אחד follicl ימפואידית PPדואר הם תאי דנדריטים זקיקים (FDCs) ומרכז התא B עשיר מרכזי נבטי, מוקף באזורים עשירים בinterfollicular תא T. דגימת האנטיגן ע"י תוצאות PPS בפיתוח + plasmablasts IgA B הסלולרי ותאי CD4 + מפעיל וזיכרון שזרע propria lamina הסביבה ולספק חסינות למגוון רחב לפולשים ריריים.
לנתח את האירועים החיסוניים המורכבים הקשורים לאנטיגן דגימה, עיבוד, והצגה בPPS הוא משימה מרתיעה, בהתחשב בעובדה שתאי PP מהווים רק חלק זעיר מכלל תאי הלימפה ברירית מעי. כדי לסייע באפיון במבחנה של תאים בסביבה זו, אנו מספקים פרוטוקול להכנה כלל תאי PP עכבר לזרימת ניתוח cytometric ופונקציונלי, כמו גם פרוטוקול להכנת PP cryosections למיקרוסקופיה וimmunohistology immunofluorescence. הפרוטוקול שלנו לבידוד, אפיון, וimmunostaining של mousדואר תאי PP הוא לא רומן כשלעצמה, כפי שמעיד עובדה שיש אזכורים רבים שראשיתה יותר מ 25 שנים המצטטים את הטכניקות הללו 5,6,9-11. במקום זאת, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה (ויזואלי) לחוקרי איסוף PPS בפעם הראשונה. את הטכניקות שבם הן שולט בקלות וללא קושי תנבנה מספר גדול של תאים עם> 90% כדאיויות תא. פרוטוקול cryosectioning מניב חלקים סדרתיים לשעתקו מאוד אידיאלי המתאימים מכתימה immunofluorescence והדמית confocal. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו משלים את שני מאמרים יופיטר אחרונים אחרים. הראשון, על ידי פוקודה ועמיתיו, מתאר את השימוש במבחני הלולאה ileal גבעול להעריך את הספיגה של חיידקים פתוגניים על ידי תאי PP M 12. השני, על ידי Geem ועמיתיו, מתאר את הבידוד והאפיון של DCS ומקרופגים מרירית מעי העכבר, אך אינו כולל באופן מפורש PPS מהניתוח שלהם 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מקבילים להכנת PP הכנות תא בודדות לזרימת ניתוח וcryosections cytometric ופונקציונלי לimmunostaining. שני שיטות לשחזור ומאוד נגישים, ובלבד cytometer זרימה וcryostat זמינים. לחוקרים בפעם הראשונה אותו יש לציין כי בהשוואה לטחול, תשואות סלולריות הכוללות מPPS הן דלות יח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים שיר Renjie (Core cytometry זרימת מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע בניתוח תא והלן ג'ונסון (Wadsworth מרכז בעלי חי היסטופתולוגיה Core) להכנת קטעי פרפין. אנו מודים לד"ר ריצ'רד א קול (Core המיקרוסקופי אור מרכז Wadsworth) לקבלת סיוע במיקרוסקופיה confocal ואוסף תמונה. ברצוננו להודות אנדי נטלי (צילום Wadsworth מרכז ואיור) לקבלת סיוע עם אנימציות.
MDJ נתמך על ידי קרן מחקר מדעי החיים, הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) מלגה. SA נתמך על ידי מלגת Wadsworth מרכז-בריאות מחקר בע"מ הבתר ביצוע עצמית. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקי NIH HD061916 וGM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
