Summary

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

Published: January 11, 2013
doi:

Summary

이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. "선형 사진 표백"표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수 있으며<em> 후 특별</em> immunostainings.

Abstract

사진 표백 순서는 NMJ에서 개인 SCS에 라벨을 할 수있는 비 침습적 방법을 제공합니다. NMJ는 포유류의 신경계의 가장 큰 시냅스이며, 시냅스 구조와 기능을 연구 모델을지도로 제공하고 있습니다. 마우스 NMJs 모터 축삭 터미널에서 근육 섬유와 꽈배기 같은 연락처 사이트 구성합니다. 모터 축삭과 터미널 SCS에 끼 우고 있습니다. 지난 수십 년 동안, 여러 가지 유전자 변형 생쥐는 각각 Thy1-XFP 1 PLP-GFP 마우스 2 예를 들어, 모터 뉴런과 SCS를 시각적으로 생성되었습니다.

모터 axons 함께 myelinating axonal SCS는 약진 액션 잠재적 인 전파를 사용하려면, Ranvier의 노드로 구분하여 겹치지 internodes에 배치된다. 대조적으로, 시냅스에서 터미널 SCS는 모니터링 및 neurotransmission를 홍보 파편과 가이드 재생의 axons을 소화 전문 glial 세포입니다. NMJs는 단단 대여섯 비 myel까지이 적용됩니다터미널 SCS를 inating – 그들이 직접 멤브레인 연락처 세에 이러한 그러나, 개별적으로, 가벼운 현미경에 의해 해결 될 수 없습니다.

여러 접근법은 개별적으로 터미널 SCS을 시각화하기 위해 존재합니다. 이 중 어느 것도하지만, 완벽한 없습니다. 예를 들어, 하나의 세포가 염색이 가득한 microelectrode에 찔려 죽은 아르 염료 충전은 두 번째 하나를 작성하기 전에 표시된 셀을 파괴해야합니다. 이 이후의 시간 경과 녹음 3 호환되지 않습니다. SCS의 멀티 스펙트럼 "Brainbow"라벨은 형광 단백질의 조합 표현 사를 사용하여 달성되었습니다. 그러나,이 기술은 여러 transgenes을 결합 필요하며 사용 발기인의 표현 패턴에 의해 제한됩니다. 앞으로 SCS에서 "사진 전환 가능한"단백질의 표정은 또 다른 대안이 다섯 수 있습니다. 여기 순차 사진 표백 한 셀이 표백 곳, 그리고 빼기 얻은 자신의 이미지를 제시한다. 우리는 믿고이 접근하는 -의 편리함과 다양성으로 인해이 -이 생체에 사용하고 다른 세포 유형, 해부학 사이트 또는 종 6 이전 할 수 있습니다 특히 neuroscientist의 기술 팔레트에 지속적인 추가를 나타냅니다.

triangularis sterni 근육의 explants에서 터미널 SCS에 대한 표백 순서와 후속 공 촛점 시간 경과 현미경의 다음 프로토콜에서, 우리는 세부 응용 프로그램을. 이, 얇은 표면 쉽게 해부하는 신경 근육 준비 7,8는 NMJ 개발, 생리와 병리 9 연구에 유용 입증되었습니다. 마지막으로, 우리는 고정 고해상도 공 촛점 이미징, immunohistochemistry 또는 ultrastructural 시험 상관 수행 한 후 triangularis sterni 근육이 준비 방법에 대해 설명합니다.

Protocol

1. Triangularis Sterni Explant (그림 1) 시간 : 15 분. 포셉 2 켤레, 가위 1 쌍, 스프링 가위 1 쌍, 1 조직 문화 요리 (10 cm) : 수술기구를 준비합니다. (15 분에 대한 최소) 미리 부풀어 오른 냉각 (4 ° C) 5 % CO 2 / 95% O 2 벨소리의 솔루션입니다. 얼음 15 cm 조직 문화 접시를 작성하고 금속 플레이트로 다룹니다. 해부 현미경을 준비하고 해부하는 동안 explant?…

Representative Results

이미징 요리 준비 triangularis sterni의 explant의 예는 그림 1G에 표시됩니다. triangularis 근육이 근육 섬유의 몇 층으로 만 구성으로 explant는 영상 NMJs 예를 생체에 특히 적합합니다. 이 유전자 변형 마우스 라인에서 파생 explants에서 고해상도 이미지를 얻을 수 있도록하는 하이라이트 SCS (PLP-GFP 2) 및 / 또는 axons (Thy1-XFP 1) 중. 고품질 영상을위한 중요한 요?…

Discussion

여기에 제시된 SC 표백 방법은 간단 신속하고 다양한입니다은 (i)는 하나의 transgene에 따라 공 촛점 현미경에 의해 단일 SC의 형태와 역학을 공개 가능 – 추가 대립 유전자를 필요로 질병 모델로 접근 예를 결합 할 때 상당한 장점 . 해부에서 고정으로 절반이 하루에 수행 할 수 있으므로 (ii) 본 방법은 빠른 것입니다. 이 같은 셀 ablations, 이미징 세포 소기관, 전기 생리학 또는 immunohistochemistry와…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 우수한 기술 지원을위한 마뉴 Budak, Ljiljana Marinkovi와 크리스티나 Wullimann 감사드립니다. 우리는 PLP-GFP 마우스를 제공하기 위해 W. 맥클린 감사드립니다. 알렉산더 – 폰 – 훔볼트 재단에 의해, 그리고 국가 기금 기관 ( "Bundesministerium 모피 Bildung 숙녀 Forschung"로, TM은 독일 Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG)의 고급 연구 연구소 (Technische Universität 뮌헨)에 의해 지원됩니다 ) ERA-NET 뉴런 'iPSoALS "와"2 광자 이미징 "의 프레임 인치 TM과 MB가 통합 단백질 과학 (뮌헨)의 센터에 의해 지원됩니다. PM은 Technische Universität 뮌헨 (죽을 차례-GS)의 대학원에 의해 지원되었다.

Materials

Name of the reagent Company (example) Catalogue number Comments (optional)
70% (vol/vol) ethanol solution Roth T913.1 in spray bottle
isoflurane Forene, Abbott any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia
transgenic mice (Plp-GFP) to be obtained from cited sources
dissection microscope with cold-light illumination Olympus SZ51 equipped with Schott KL 1500 LCD
forceps #2 Fine Science Tools 11233-20
forceps #5 Fine Science Tools 11295-00
scissors, large medical Fine Science Tools 14108-09
scissors, small angled spring Fine Science Tools 15033-09
in-line heater Warner Instruments SF-28
heating ring for 3.5-cm dishes Warner Instruments 64-0110 DH-35
two channel temperature control system Warner Instruments TC-344B
superfusion pump system custom-built
15-cm tissue culture dish Sarstedt 83.1803.003 filled with ice and covered by metal plate
10-cm tissue culture dish Sarstedt 83.1802.003 with oxygenated Ringer’s solution
3.5-cm tissue culture dish Sarstedt 83.1800.003 filled with Sylgard polymer
Sylgard polymer Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
confocal microscope Olympus FV1000 with argon laser
50-ml reaction tube Sarstedt 62.547.254 PP
4% PFA in PBS Sigma P6148
cannula 0.5 mm x 25 mm Neolab E-1510
syringe 1 ml Neolab E-1496
synaptophysin antibody Invitrogen 18-0130 rabbit
secondary antibody Invitrogen A-11012 Alexa 594
24-well plate Sarstedt 83.1836
0.01 M PBS Sigma P4417
0.1 M glycine in PBS Roth 3790.1
coverslips Neolab E-4132
slides Neolab E-4121
Vectashield Vector labs H-1000
minutien pins ×10 Fine Science Tools 26002-20 shortened to < 4 mm
α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 Invitrogen (Molecular Probes) B-13423
Blocking Solution
0.01 M PBS
0.2% Triton-X100 Roth 3051.3
10% Normal Goat Serum Abcam ab7481
1% bovine serum albumin Sigma A7030
Ringer
bubbled with 95% O2 /5% CO2
125 mM NaCl Sigma S7653
2.5 mM KCl Sigma P9333
1.25 mM NaH2PO4 Sigma S8282
26 mM NaHCO3 Sigma S6297
2 mM CaCl2 Sigma 21114
1 mM MgCl2 Sigma 63020
20 mM glucose Sigma G7528

Table 1. Specific reagents and equipments.

References

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Cite This Article
Brill, M. S., Marinković, P., Misgeld, T. Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (71), e4460, doi:10.3791/4460 (2013).

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