Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie
Summary
Visualiseren individuele cellen in dicht opeengepakte weefsels, zoals terminal Schwann-cellen (SC) op neuromusculaire verbindingen (NMS), is een uitdaging. "Sequential foto-bleken" laat de afbakening van een enkele terminal SC's, bijvoorbeeld in de triangularis sterni spier explantatie, een handige zenuw-spier voorbereid, indien sequentiële bleken kan worden gecombineerd met time-lapse imaging en<em> Post-hoc</em> Immunostainings.
Abstract
Sequential foto-bleken is een niet-invasieve manier om afzonderlijke SC label aan de NMJ. De NMS is de grootste synaps van de zoogdieren zenuwstelsel en heeft gediend als leidraad model om synaptische structuur en functie te bestuderen. In de muis NMS motor axon terminals vormen krakeling-achtig contact sites met spiervezels. De motor axon en de terminal zijn ommanteld door SCS. In de afgelopen decennia zijn verschillende transgene muizen werden gegenereerd om motorneuronen en SC's te visualiseren, bijvoorbeeld Thy1-XFP 1 en PLP-GFP muizen 2, respectievelijk.
Langs de motor axonen, worden myeliniserende axonale SC's gerangschikt in niet-overlappende internodiën, gescheiden door knopen van Ranvier, om sprongsgewijze actiepotentiaal voortplanting mogelijk te maken. In tegenstelling, terminal SC's op de synaps zijn gespecialiseerde gliale cellen, die te bewaken en te bevorderen neurotransmissie, verteren puin en gids regenererende axonen. NMS zijn strak gedekt door tot een half dozijn niet-myelinating terminal SC's – deze kunnen echter niet afzonderlijk worden opgelost door middel van lichtmicroscopie, omdat ze in direct contact membraan 3.
Verschillende benaderingen bestaan om individueel visualiseren terminal SC. Geen van deze zijn onberispelijk, dat wel. Bijvoorbeeld, kleurstof vullen, waarbij enkele cellen worden gespietst met een kleurstof gevulde micro-elektrode, vereist het vernietigen van een gelabelde cel alvorens in een tweede. Dit is niet compatibel met de volgende time-lapse opnames 3. Multispectrale "Brainbow" etikettering van SCS is bereikt door combinatorische expressie van fluorescerende eiwitten 4. Deze techniek heeft waarin verschillende transgenen en wordt begrensd door het expressiepatroon van de promoters gebruikt. In de toekomst zou expressie van "photo-schakelbare" eiwitten in SCS nog een andere alternatieve 5. Hier presenteren we sequentiële foto-bleken, waarbij enkele cellen worden gebleekt, en hun imago verkregen door aftrekking. Wij gelovendat deze benadering – vanwege het gemak en de veelzijdigheid – is een blijvende Naast technologie de neurowetenschapper palet, vooral omdat het kan worden gebruikt in vivo en overgebracht naar andere celtypen lokalisaties of soorten 6.
In het volgende protocol, ingegaan op de toepassing van de sequentiële bleken en de daaropvolgende confocale time-lapse microscopie op klem SC's in triangularis sterni spier explantaten. Deze dunne, oppervlakkige en gemakkelijk ontleed zenuw-spier voorbereiding 7,8 nuttig is gebleken voor studies van NMJ ontwikkeling, fysiologie en pathologie 9. Tot slot leggen we uit hoe de triangularis sterni spier bereid is na fixatie uit te voeren gecorreleerd met een hoge resolutie confocale beeldvorming, immunohistochemie of ultrastructurele examens.
Protocol
Representative Results
Discussion
De SC bleken methode hier gepresenteerde is eenvoudig, snel en veelzijdig: (i) Het maakt onthullend enkele SC morfologie en dynamiek door confocale microscopie op basis van een enkel transgen – en dat is een belangrijk voordeel bij het combineren van de benadering, die bijv. met de ziekte van modellen die extra allelen nodig . (Ii) De werkwijze is snel, zoals dissectie van de fixatie kan worden uitgevoerd in een halve dag. (Iii) Het aantal toepassingen is breed, als het kan worden gecombineerd met andere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi en Kristina Wullimann bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken W. Macklin voor het verstrekken van PLP-GFP muizen. TM wordt ondersteund door het Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), door de Alexander-von-Humboldt-stichting en door de nationale financiering agentschap ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) in het kader van ERA-Net NEURON "iPSoALS" en "2-foton beeldvorming". TM en MB worden ondersteund door het Centrum voor Geïntegreerde Protein Science (München). PM werd gesteund door de Graduate School van de Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
