Summary

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Published: January 11, 2013
doi:

Summary

Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. "Sequential Fotobleichen" ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können und<em> Post-hoc</em> Immunfärbungen.

Abstract

Sequentielle Photobleichen stellt eine nicht-invasive Methode zur individuellen SCs im NMJ etikettieren. Die NMJ ist die größte Synapsen des Nervensystems der Säuger-System und ist als Leitbild zur synaptischen Struktur und Funktion zu untersuchen serviert. In Maus NMJs Motors Axonterminalen bilden Brezel-like Kontaktstellen mit Muskelfasern. Der Motor Axon und sein Terminal werden von SCs ummantelt. In den vergangenen Jahrzehnten haben mehrere transgene Mäuse generiert, um Motoneuronen und SCs visualisieren, zum Beispiel Thy1-XFP 1 und Plp-GFP Mäusen 2.

Motor entlang Axone werden myelinisierenden axonalen SCs in nicht überlappenden Internodien angeordnet, getrennt durch Knoten Ranvier, um saltatorische Aktionspotential Ausbreitungsrichtung aktivieren. Im Gegensatz dazu sind Endgerät SCs an der Synapse spezialisierten Gliazellen, welche zu überwachen und zu fördern Neurotransmission, verdauen Schutt und Führung regenerierenden Axone. NMJs eng um bis zu einem halben Dutzend nicht MYEL abgedecktinating Endgerät SCs – dies kann jedoch nicht durch Lichtmikroskopie individuell aufgelöst werden, da sie in direktem Kontakt Membran 3 befinden.

Mehrere Ansätze existieren individuell visualisieren Terminal SCs. Keiner von ihnen sind makellos, though. Zum Beispiel erfordert Farbstoff Füllung, wobei einzelne Zellen mit einem Farbstoff gefüllten Mikroelektrode aufgespießt werden, Zerstören eines markierten Zelle vor dem Befüllen eine zweite. Dies ist nicht kompatibel mit anschließender Zeitraffer-Aufnahmen 3. Multispektrales "Brainbow" Kennzeichnung von SCs ist durch Verwendung kombinatorischer Expression von fluoreszierenden Proteinen 4 erreicht. Allerdings erfordert diese Technik, die mehrere Transgene und wird durch die Expressionsmuster der verwendeten Promotoren beschränkt. In Zukunft könnte Ausdruck "photoschaltbare" Proteine ​​in SCs noch eine andere alternative 5 sein. Hier präsentieren wir sequentielle Fotobleichen, wo einzelne Zellen gebleicht werden, und ihr Image durch Subtraktion erhalten. Wir glauben,dass dieser Ansatz – aufgrund seiner Einfachheit und Vielseitigkeit – eine dauerhafte Neben der Neurowissenschaftler Technologie-Palette, zumal es in vivo verwendet werden können und auf andere übertragen Zelltypen, anatomischen oder Arten 6.

In dem folgenden Protokoll, Detail wir die Anwendung der sequentiellen Bleichen und anschließende konfokale Zeitraffer-Mikroskopie an Klemme SCs in triangularis sterni Muskel-Explantaten. Diese dünne, oberflächliche und einfach zerlegt Nerv-Muskel-Präparat 7,8 hat sich für ein Studium der NMJ Entwicklung, Physiologie und Pathologie 9 nützlich. Schließlich erklären wir, wie die triangularis sterni Muskeln bereit ist nach der Fixierung durchzuführen korreliert hochauflösende konfokale Bildgebung, Immunhistochemie oder ultrastrukturelle Untersuchungen.

Protocol

Ein. Triangularis Sterni Explantation (Abbildung 1) Timing: 15 min. Bereiten chirurgische Instrumente: 2 Paar Zangen, 1 Schere, 1 Paar Frühjahr Schere, 1 Gewebekulturschale (10-cm). Pre-Blasen (mindestens 15 min) gekühlt (4 ° C) Ringer-Lösung mit 5% CO 2/95% O 2. Füllen Sie 15-cm Gewebekulturschale mit Eis und bedecken Sie es mit Metallplatte. Planen Dissektionsmikroskop und legen die 15-cm-Schale mit Eis unter der Dissektion Umfang um d…

Representative Results

Ein Beispiel eines triangularis sterni Explantat bereit zum Abbilden Schale wird in Figur 1G gezeigt. Diese Explantat eignet sich besonders für bildgebende NMJs ex vivo als die triangularis Muskel besteht nur aus wenigen Lagen von Muskelfasern. Dies ermöglicht den Erhalt hochauflösende Bilder von Explantaten aus transgenen Maus Linien abgeleitet werden, dass entweder Highlight SCs (Plp-GFP 2) und / oder Axone (Thy1-XFP 1). Kritische Faktoren für hohe …

Discussion

Der SC Bleichen hier vorgestellte Methode ist einfach, schnell und vielseitig: (i) Es ermöglicht enthüllt einzigen SC Morphologie und Dynamik durch konfokale Mikroskopie auf einer einzigen Transgen basiert – und das ist ein wesentlicher Vorteil bei der Kombination der Ansatz z. B. mit der Krankheit Modelle, die zusätzliche Allele erfordern . (Ii) Das Verfahren ist schnell, wie aus Dissektion zur Fixation in einem halben Tag durchgeführt werden kann. (Iii) Die Anzahl der Anwendungen ist breit, wie es mit and…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi und Kristina Wullimann für hervorragende technische Unterstützung danken. Wir danken W. Macklin für die Bereitstellung Plp-GFP Mäusen. , Von der Alexander-von-Humboldt-Stiftung und von der nationalen Förderagentur ("Bundesministerium für Bildung und Forschung"; TM wird durch das Institut für Höhere Studien (Technische Universität München), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) unterstützt ) im Rahmen des ERA-Net NEURON "iPSoALS" und "2-Photonen-Imaging". TM und MB werden vom Center for Integrated Protein Science (München) unterstützt. PM wurde von der Graduate School der Technischen Universität München (TUM-GS) unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company (example) Catalogue number Comments (optional)
70% (vol/vol) ethanol solution Roth T913.1 in spray bottle
isoflurane Forene, Abbott any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia
transgenic mice (Plp-GFP) to be obtained from cited sources
dissection microscope with cold-light illumination Olympus SZ51 equipped with Schott KL 1500 LCD
forceps #2 Fine Science Tools 11233-20
forceps #5 Fine Science Tools 11295-00
scissors, large medical Fine Science Tools 14108-09
scissors, small angled spring Fine Science Tools 15033-09
in-line heater Warner Instruments SF-28
heating ring for 3.5-cm dishes Warner Instruments 64-0110 DH-35
two channel temperature control system Warner Instruments TC-344B
superfusion pump system custom-built
15-cm tissue culture dish Sarstedt 83.1803.003 filled with ice and covered by metal plate
10-cm tissue culture dish Sarstedt 83.1802.003 with oxygenated Ringer’s solution
3.5-cm tissue culture dish Sarstedt 83.1800.003 filled with Sylgard polymer
Sylgard polymer Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
confocal microscope Olympus FV1000 with argon laser
50-ml reaction tube Sarstedt 62.547.254 PP
4% PFA in PBS Sigma P6148
cannula 0.5 mm x 25 mm Neolab E-1510
syringe 1 ml Neolab E-1496
synaptophysin antibody Invitrogen 18-0130 rabbit
secondary antibody Invitrogen A-11012 Alexa 594
24-well plate Sarstedt 83.1836
0.01 M PBS Sigma P4417
0.1 M glycine in PBS Roth 3790.1
coverslips Neolab E-4132
slides Neolab E-4121
Vectashield Vector labs H-1000
minutien pins ×10 Fine Science Tools 26002-20 shortened to < 4 mm
α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 Invitrogen (Molecular Probes) B-13423
Blocking Solution
0.01 M PBS
0.2% Triton-X100 Roth 3051.3
10% Normal Goat Serum Abcam ab7481
1% bovine serum albumin Sigma A7030
Ringer
bubbled with 95% O2 /5% CO2
125 mM NaCl Sigma S7653
2.5 mM KCl Sigma P9333
1.25 mM NaH2PO4 Sigma S8282
26 mM NaHCO3 Sigma S6297
2 mM CaCl2 Sigma 21114
1 mM MgCl2 Sigma 63020
20 mM glucose Sigma G7528

Table 1. Specific reagents and equipments.

References

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  2. Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
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Cite This Article
Brill, M. S., Marinković, P., Misgeld, T. Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (71), e4460, doi:10.3791/4460 (2013).

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