Summary

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em> Drosophila</em

Published: December 04, 2012
doi:

Summary

Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in<em> Drosophila</em> Durante l'infezione batterica, nonché la capacità di mosche di montare una risposta immunitaria per la sopravvivenza di controllo, carica batterica, e in tempo reale delle attività di un regolatore chiave dell'immunità innata, NFκB.

Abstract

Una complessa interazione tra la risposta immunitaria e comportamento host è stato descritto in una vasta gamma di specie. Sonno eccesso, in particolare, si verifica come risposta a infezione nei mammiferi e 1 è stata recentemente descritta in Drosophila melanogaster 2. E 'generalmente accettato che il sonno è vantaggioso per l'host durante un'infezione e che è importante per il mantenimento di un robusto sistema immunitario 3,4. Tuttavia, prove sperimentali che supporta questa ipotesi è limitata 4, e la funzione del sonno eccesso durante una risposta immunitaria è chiaro. Abbiamo usato un approccio multidisciplinare per affrontare questo problema complesso, e hanno condotto studi nel sistema semplice modello genetico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Usiamo un test standard per misurare il comportamento locomotorio e dormire in mosche, e dimostrare come questo test viene utilizzato per misurare il comportamento di mosche infected con un ceppo di batteri patogeni. Questo saggio è utile anche per monitorare la durata della sopravvivenza in mosche singoli durante un'infezione. Ulteriori misure della funzione immunitaria includono la capacità di mosche per cancellare una infezione e l'attivazione di NFκB, un fattore di trascrizione chiave che è fondamentale per la risposta immunitaria innata in Drosophila. Sia esito di sopravvivenza e la clearance batterica durante l'infezione insieme sono indicatori di resistenza e tolleranza alle infezioni. Resistenza si riferisce alla capacità di mosche per cancellare un'infezione, mentre la tolleranza viene definita come la capacità di accoglienza per limitare i danni di un'infezione e quindi sopravvivere nonostante alti livelli di patogeni all'interno del sistema 5. Monitoraggio in tempo reale delle attività in corso di infezione NFκB permette di comprendere un meccanismo molecolare di sopravvivenza durante l'infezione. L'uso di Drosophila in questi saggi semplici facilita le analisi genetiche e molecolari di sonnoe la risposta immunitaria e come questi due sistemi complessi sono reciprocamente influenzati.

Protocol

Questo protocollo utilizza due configurazioni (Figura 1) per acquisire quattro letture differenti raccolti da mosche sottoposte ad una infezione batterica. Queste uscite sono 1) sonno / veglia comportamento, 2) esito di sopravvivenza; 3) carica batterica al volo e 4) misurazione in tempo reale di attività giornalista NFκB in vivo. In combinazione con gli strumenti genetici che sono disponibili in Drosophila, queste misurazioni forniscono informazioni meccanicistica sul legame molecol…

Representative Results

Infezione favorisce il sonno. In questo esempio, Canton-S (CS) mosche wild type e mosche mutanti privi di un gene NFκB, Relish (Rel E20) 14, sono stati caricati in due DAM2 controlla l'attività (n = 32 per ogni genotipo) ed infettati come descritto sopra. Mosche sono stati mantenuti in luce costante per eliminare l'influenza dell'orologio circadiano sul comportamento e infezione 2,7,8. I mutanti sono stati E20 Rel isogenized al CS come descritto in precedenza <su…

Discussion

Questo protocollo delinea un approccio per studiare come comportamento, particolarmente dormire, è connesso a parametri di risposta immunitaria. Questi parametri includono la carica batterica, esito di sopravvivenza, e l'attività NFκB come misurato da un reporter luciferasi in vivo. Insieme essi danno informazioni su quanto bene una mosca in grado di combattere l'infezione. Carica batterica e dei risultati di sopravvivenza sono parametri di risposta immunitaria che comportano una misura semplice in <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation in concessione # IOS-1025627 e dal National Institutes of Health in concessione # 1R21NS078582-01 a JAW

Materials

Material Name Company Catalogue number Comments
Equipment
Incubators Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate.
Drosophila Activitiy Monitors Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories.
Pyrex Glass Tubes Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5×65
Microplate scintillation and luminescence counter Perkin Elmer TopCount NXT
12 detector
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates.
FluorChem 8900 Alpha Innotech Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient.
Micropipette Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Supplies
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Syringe Fisher Scientific BD 305482
Syringe Needles Fisher Scientific BD 305196 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing.
Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) VWR 60985-706 Used for attaching glass capillary needles to a syringe
3 Way Stopcock American Pharmaseal Company K75
Kontes Pellet Pestle Cordless Motor Fisher Scientific K749540-0000
Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749521-1590
Glass balls 3mm VWR 26396-630
Microplate Microlite 1+ Thermo Scientific 7571 Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque.
TopSeal-A:96-well Microplates PerkinElmer 6005185 Microplate Press-On Adhesive Sealing Film
D-Luciferin, Potassium Salt Gold BioTechnology, Inc. LUCNA
Software
Insomniac2 Available upon request to the authors custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11
Drosonex Available upon request to the authors custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system
Photoshop CS3 Adobe Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional)

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Cite This Article
Kuo, T., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila. J. Vis. Exp. (70), e4355, doi:10.3791/4355 (2012).

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