Количественные измерения иммунного ответа и сна в<em> Drosophila</em
Summary
Чтобы понять связь между иммунной реакции и поведение, мы опишем метод измерения опорно-двигательного поведения в<em> Drosophila</em> Во время бактериальной инфекции, а также способность мух монтировать иммунного ответа путем мониторинга выживание, бактериальной нагрузки и в режиме реального времени активности ключевого регулятора врожденного иммунитета, NFkB.
Abstract
Сложное взаимодействие между иммунным ответом и принимающей поведения был описан в широком диапазоне видов. Превышение сна, в частности, как известно, происходит в ответ на инфекцию в организме млекопитающих 1 и также недавно были описаны в дрозофилы 2. Принято считать, что сон приносит пользу принимающей во время инфекции и, что очень важно для поддержания надежной иммунной системы 3,4. Однако экспериментальные доказательства того, что поддерживает эту гипотезу ограничено 4, а функция избыточного сна во время иммунного ответа остается неясным. Мы использовали комплексный подход к решению этой сложной проблемы, и провели исследования в простую генетическую модель системы, fruitfly дрозофилы. Мы используем стандартный тест для измерения опорно-двигательного поведения и сна у мух, и продемонстрировать, как этот анализ используется для оценки поведения мух infecteD с патогенным штаммом бактерии. Этот анализ также полезен для мониторинга продолжительность жизни в отдельных мухи во время инфекции. Дополнительные меры иммунной функции включают в себя возможность мух для очистки инфекции и активации NFκB, ключевой фактор транскрипции, который играет центральную роль в врожденного иммунного ответа у дрозофилы. Оба результата выживания и бактериальные инфекции во время оформления вместе являются показателями устойчивости и толерантности к инфекции. Сопротивление относится к способности мух для очистки инфекции, в то время как толерантность определяется как способность принимающего ограничить ущерб от инфекции и тем самым выжить, несмотря на высокий уровень возбудителя в рамках системы 5. В режиме реального времени мониторинг активности NFκB во время инфекции обеспечивает понимание молекулярного механизма выживания во время инфекции. Использование Drosophila в этих анализах просто облегчает генетические и молекулярные анализы снаи иммунного ответа и, как эти две сложные системы взаимно влияют.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает подход, чтобы исследовать, как поведение, особенно во время сна, связан с иммунной параметры ответа. Эти параметры включают бактериальную нагрузку, выживаемостью, и NFκB деятельности как измеряется с помощью люциферазы репортера в естественных условиях. Вме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при поддержке Национального научного фонда, грант # IOS-1025627 и Национального института здоровья в рамках гранта # 1R21NS078582-01 в челюсть
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. 遗传学. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. 遗传学. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. . The social life of animals. , (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
