Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em> Drosophila</em
Summary
Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor em<em> Drosophila</em> Durante a infecção bacteriana, bem como a capacidade das moscas de montar uma resposta imune pela sobrevivência de monitorização, a carga bacteriana e, em tempo real, a actividade de um regulador chave da imunidade inata, NFkB.
Abstract
A interacção complexa entre a resposta imune e comportamento hospedeiro tem sido descrito em uma grande variedade de espécies. Excesso de sono, em particular, é conhecida a ocorrência de uma resposta à infecção em mamíferos 1 e recentemente também tem sido descrita em Drosophila melanogaster 2. É geralmente aceite que o sono é benéfico para o hospedeiro durante a infecção, e que é importante para a manutenção de um sistema imunológico robusto 3,4. No entanto, a evidência experimental que suporta esta hipótese é limitada 4, e a função do sono em excesso durante uma resposta imune permanece obscura. Nós usamos uma abordagem multidisciplinar para resolver este problema complexo, e realizaram estudos no sistema modelo simples genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Usamos um ensaio padrão para medir o comportamento locomotor e do sono em moscas, e demonstrar como este ensaio é utilizado para medir o comportamento de moscas infected com uma estirpe patogénica de bactérias. Este teste é também útil para monitorizar a duração de sobrevivência em moscas individuais durante uma infecção. Medidas adicionais de função imunitária incluem a capacidade de moscas para limpar uma infecção e à activação de NFkB, um factor de transcrição essencial, que é essencial para a resposta imune inata em Drosophila. Tanto resultado da sobrevivência e depuração bacteriana durante a infecção em conjunto são indicadores de resistência e de tolerância à infecção. Resistência se refere à capacidade de moscas para limpar uma infecção, enquanto que a tolerância é definida como a capacidade do hospedeiro para limitar os danos de uma infecção e, assim, sobrevivem apesar dos níveis elevados de agentes patogénicos no interior do sistema 5. Monitoramento em tempo real da atividade NFkB durante a infecção fornece insights sobre um mecanismo molecular de sobrevivência durante a infecção. O uso de Drosophila nestes ensaios simples facilita as análises genéticas e moleculares do sonoe a resposta imune e como estes dois sistemas complexos são reciprocamente influenciadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve uma abordagem para investigar como o comportamento, particularmente dormir, está ligada a parâmetros de resposta do sistema imunológico. Estes parâmetros incluem a carga bacteriana, resultado da sobrevivência e actividade de NFkB, como medido por um repórter de luciferase in vivo. Juntos, esses parâmetros fornecem informações sobre o quão bem uma mosca pode lutar contra uma infecção. A carga bacteriana e os resultados de sobrevivência são parâmetros da resposta imune que e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, Grant # IOS-1025627 e pelo Instituto Nacional de Saúde sob concessão # 1R21NS078582-01 a JAW
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
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