We beschrijven twee methoden voor voorwaardelijke<em> Trans</em>-Complementatie van het hepatitis C virus (HCV) montage en de voltooiing van de volledige virale levenscyclus, die afhankelijk zijn van heterokaryon formatie. Deze technieken zijn geschikt voor het screenen op cellijnen dat de dominante beperking factoren, die de productie van besmettelijke HCV nakomelingen weg te drukken.
Hepatitis C virus (HCV) is een hepatotrope virus met een gastheer-range beperkt tot mensen en chimpansees. Hoewel HCV-RNA-replicatie is waargenomen bij de mens niet-lever-en muizen cellijnen, het rendement was erg laag en de vereiste lange termijn selectieprocedures met HCV replicon bouwt uiten dominante antibiotica-selecteerbare merkers 1-5. HCV-in-vitro-onderzoek is dan ook beperkt tot humane lever cellijnen permissief voor virus in-en voltooiing van de virale levenscyclus. Door de smalle soorten tropisme zware bedrijfsvoertuigen, is er geen immunocompetente klein diermodel beschikbaar bevorderen die voor de volledige HCV replicatiecyclus 6-8. Inefficiënte replicatie van HCV in niet-menselijke cellen bijvoorbeeld van de muis herkomst is waarschijnlijk te wijten aan een gebrek aan genetische onverenigbaarheid van essentiële gastheer afhankelijkheid factoren en / of expressie van beperking factoren.
We hebben onderzocht of HCV voortplanting wordt onderdrukt door dominante beperking factors in een menselijke cellijnen afgeleid van niet-lever weefsels of muizenlever cellijnen. Hiervoor ontwikkelden we twee onafhankelijke voorwaardelijke trans-aanvulling methoden te vertrouwen op somatische celfusie. In beide gevallen voltooiing van de virale replicatie cyclus slechts mogelijk in de heterokaryons. Bijgevolg succesvolle trans-complementatie, die wordt bepaald door de novo productie van infectieuze virale nageslacht geeft geen dominerende beperkingen.
In het bijzonder werden subgenome HCV replicons het dragen van een luciferase transgen getransfecteerd in zeer tolerant humane lever cellen (Huh-7.5-cellen). Vervolgens werden deze cellen samen gekweekt en gefuseerd met verschillende menselijke en muizen cellen die HCV structurele eiwitten kern omhulling 1 en 2 (E1, E2) en extra eiwitten P7 en NS2. Mits celfusie werd gestart door behandeling met polyethyleenglycol (PEG), de cultuur vrijgegeven infectieuze virus paARTIKELEN die naïeve cellen die geïnfecteerd zijn in een receptor-afhankelijke manier.
Om de invloed van de dominante beperkingen op de volledige virale levenscyclus zoals mobiele toegang, RNA-vertaling, replicatie en assemblage virus te beoordelen, hebben we geprofiteerd van een menselijke lever cellijn (Huh-7 Lunet N cellen 9), die endogene expressie van CD81 mist, essentieel ingang factor HCV. Aangezien ectopisch tot expressie CD81, deze cellen in wezen ongevoelig HCV infectie 10. Belangrijk is dat bij gelijktijdige gekweekt en versmolten met cellen die de menselijke CD81 maar gebrek in ieder geval een andere cruciale celinvoer factor (dat wil zeggen SR-BI, CLDN1, OCLN) uit te drukken, alleen de resulterende heterokaryons weer te geven van de complete set van HCV toegang factoren vereiste voor de infectie. Daarom, om te analyseren als dominante beperking factoren onderdrukken voltooiing van de HCV replicatie cyclus, we Lunet N cellen gefuseerd met verschillende cellen van mens en muis oorsprong die de hierboven genoemde crit voldoenERIA. Als co-gekweekte cellen werden getransfecteerd met een zeer fusogeen virale manteleiwit mutant van de prototype schuimende virus (PFV 11) en vervolgens uitgedaagd met infectieuze HCV deeltjes (HCVcc) werd de novo productie van infectieus virus waargenomen. Dit geeft aan dat HCV succes zijn replicatie voltooid heterokaryons dus uitgesloten expressie van dominant beperking factoren deze cellijnen. Deze nieuwe voorwaardelijke trans-aanvulling methoden zal nuttig zijn om een groot panel van cellijnen en primaire cellen screenen voor de expressie van HCV-specifieke dominante beperking factoren.
We twee methoden heterokaryon vorming in gekweekte cellen induceren voor de analyse van dominant negatieve beperkingen die HCV weg. Met deze procedures we niet de aanwezigheid van een dominante constitutief of virus-geïnduceerde factor in verschillende humane niet-lever en in muizen lever cellijnen. De eerste test analyseert in de eerste plaats als beperking factoren te voorkomen HCV-assemblage en het vrijkomen van besmettelijke nageslacht. Aangezien in dit geval de inpakcellen zijn gefuseerd met HCV replicon cellen mo…
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn dankbaar Takaji Wakita en Jens Bukh voor JFH1 en J6CF isolaten, respectievelijk. Verder danken wij Charles Rice voor Huh-7.5-cellen en het 9E10 antilichaam, Steven Foung voor de E2-specifieke antilichaam CBH-23, en alle leden van de afdeling Experimentele Virologie, Twincore voor nuttige suggesties en discussies.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |