Dois métodos de formação de heterocários Descobrir Fatores de restrição HCV

Vírus da hepatite C (HCV) é um vírus hepatotrópico com uma gama de hospedeiros restrita aos seres humanos e chimpanzés. Embora HCV replicação de RNA tem sido observada em linhas de células humanas não-hepáticas e de murídeo, a eficiência foi muito baixa e necessários procedimentos de longo prazo de selecção utilizando HCV replicão constrói expressando dominantes antibiótico-seleccionáveis ​​marcadores ^1-5. HCV in vitro de pesquisa é, portanto, limitados a linhas celulares de hepatoma humano permissivas para a entrada do vírus e conclusão do ciclo de vida do vírus. Devido a HCVs tropismo espécies estreito, não existe nenhum modelo animal imunocompetente pequena disponível que sustenta o ciclo de replicação do HCV completa ^6-8. Replicação ineficiente do HCV em células não-humanos, por exemplo de origem do rato é provavelmente devido à falta de incompatibilidade genética de factores do hospedeiro essenciais de dependência e / ou expressão de factores de restrição.

Investigamos se a propagação HCV é suprimida por fa restrição dominantectors em qualquer linhas de células humanas derivadas de tecidos não-hepáticas, ou em linhas de células do fígado de rato. Para este fim, desenvolvemos dois independentes condicionais de complementação trans métodos que dependem somática fusão celular. Em ambos os casos, a conclusão do ciclo de replicação viral só é possível em os heterocariontes. Por conseguinte, a complementação trans-sucesso, o que é determinado por medição da produção de novo de descendência virai infecciosa, indica ausência de restrições dominantes.

Especificamente, subgenómico replicões de HCV que transportam um transgene de luciferase foram transfectados para altamente permissivas células de hepatoma humano (Huh-7.5 células). Subsequentemente, estas células foram co-cultivados e fundidos a várias células humanas e de murino expressando HCV núcleo proteínas estruturais, envelope 1 e 2 (E1, E2) e acessório proteínas p7 e NS2. Desde que a fusão celular foi iniciada por meio de tratamento com polietileno-glicol (PEG), a cultura libertado infecciosa virai aaARTIGOS que as células infectadas sem tratamento prévio de uma forma do receptor-dependente.

Para avaliar a influência das restrições dominantes sobre o ciclo de vida viral, incluindo entrada de célula, tradução do RNA, replicação e montagem do vírus, que se aproveitou de uma linha celular humana do fígado (Huh-7 células Lunet N ⁹⁾ que não tem expressão endógena de CD81, um factor de entrada essencial do HCV. Na ausência de CD81 ectopicamente expressa, estas células são essencialmente refractário para infecção por VHC ^10. Importante, quando co-cultivadas e fundidos com células que expressam CD81 humano, mas falta pelo menos um outro fator fundamental a entrada de células (ou seja, SR-BI, CLDN1, OCLN), apenas os resultantes heterocários exibir o conjunto completo de fatores de entrada HCV necessárias para a infecção. Portanto, para analisar se factores de restrição dominantes suprimir a conclusão do ciclo de replicação do HCV, que fundiram células Lunet N com várias células de origem humana e do rato que preenchem a crit acima mencionadoeria. Quando a co-cultura de células foram transfectadas com uma proteína do envelope viral altamente fusogénicos mutante do vírus sincicial protótipo (PFV ¹¹⁾ e subsequentemente desafiados com partículas infecciosas HCV (HCVcc), de novo de produção de vírus infeccioso foi observada. Isso indica que o HCV concluído com êxito o seu ciclo de replicação em heterocárions descartando assim a expressão de fatores de restrição dominantes nessas linhas celulares. Estas novas condicionais de complementação-trans métodos serão úteis para pesquisar uma grande painel de linhas celulares e células primárias para a expressão de factores específicos de HCV de restrição dominantes.