שתי שיטות של גיבוש Heterokaryon לגלות גורמים הגבלת HCV
Summary
נתאר שתי שיטות מותנה<em> טראנס</em>-השלמה של הפטיטיס C (HCV) הרכבה השלמת מחזור החיים המלא ויראלי, אשר מסתמכים על היווצרות heterokaryon. טכניקות אלו מתאימות למסך של שורות תאים המבטאים הגבלה גורמים דומיננטיים, אשר המונעים הייצור של הצאצאים HCV זיהומיות.
Abstract
הפטיטיס C (HCV) הוא וירוס hepatotropic עם טווח המארח מוגבל לבני אדם ושימפנזים. למרות שכפול HCV RNA נצפתה האדם שורות תאים בכבד שאינם ואת Murine, יעילות היה נמוך מאוד הדרושים לטווח ארוך הליכי הבחירה באמצעות HCV replicon בונה ביטוי הדומיננטיות לאנטיביוטיקה לבחירה סמנים 1-5. HCV במבחנה מחקר מוגבל ולכן האדם שורות תאים hepatoma מתירנית לכניסה וירוס השלמת מחזור החיים של נגיפי. בשל HCVs זיקה מינים צרה, אין מודל immunocompetent חיים קטן זמין המקיים את מחזור השכפול מלאה HCV 6-8. שכפול יעיל של HCV ב שאינם בני אדם בתאי למשל ממוצא העכבר סביר להניח עקב חוסר התאמה גנטית של חיוניות תלות בגורמים המארחות / או ביטוי של גורמים הגבלה.
אנו בדקו האם ריבוי HCV מדוכאת על ידי fa הגבלת הדומיננטיתctors ב משני שורות תאים אנושיים שמקורם בכבד ללא רקמות או בכבד קווי עכבר סלולריים. לשם כך, פיתחנו שני עצמאיים תנאי השלמה חוצה שיטות בהסתמך על איחוי תאים סומטיים. בשני המקרים, סיום מחזור השכפול הנגיפי אפשרית רק את heterokaryons. כתוצאה מכך, השלמה מוצלחת טרנס, אשר נקבע על ידי מדידת ייצור דה נובו של הצאצאים ויראלית מדבקת, מצביע על העדר הגבלות דומיננטיים.
באופן ספציפי, replicons HCV subgenomic הנושאים transgene בלוציפראז היו transfected אל מתירנית מאוד התאים hepatoma אדם (הא, 7.5 תאים). כתוצאה מכך, התאים הללו לשתף בתרבית התמזגו לתאים אנושיים Murine שונים להביע HCV הליבה חלבונים מבניים, מעטפה 1 ו – 2 (E1, E2) וחלבונים אביזר P7 ו NS2. ובלבד איחוי תאים יזם טיפול גליקול, פוליאתילן (PEG), תרבות פרסמה הרשות ויראלית מדבקתrticles אשר נגועים בתאי נאיביות באופן הקולטן תלוי.
כדי להעריך את השפעת הגבלות הדומיננטיים על מחזור החיים המלא ויראלי כולל כניסת התא, RNA, שכפול תרגום והרכבה וירוס, אנחנו ניצלו את קו התא האנושי הכבד (הא-7 Lunet תאים נ 9), אשר אין ביטוי אנדוגני של CD81, גורם חיוני הכניסה של HCV. בהעדר CD81 הביע ectopically, תאים אלו הם בעצם עקשן לזיהום HCV 10. חשוב לציין, כאשר שיתוף תרבותי התמזגו עם תאים המבטאים CD81 האדם אבל חוסר לפחות תא אחר כניסת גורם מכריע (כלומר SR-BI, CLDN1, OCLN), רק את heterokaryons כתוצאה להציג את מערכת שלמה של גורמים כניסה HCV הנדרשים על זיהום. לכן, כדי לנתח אם הגורמים הדומיננטיים הגבלת לדכא את השלמת מחזור שכפול HCV, אנו התמזגו Lunet תאים N עם תאים שונים ממקור אנושי עכבר למלא מכה קריטית כאמורeria. כאשר שיתוף בתרבית תאים היו transfected עם חלבון fusogenic ביותר מעטפת הנגיף מוטציה של הנגיף מוקצף אב טיפוס (PFV 11) ו תיגר לאחר מכן עם זיהומיות חלקיקים (HCV HCVcc), דה נובו הייצור של הנגיף מדבק נצפתה. זה מצביע על כך HCV בהצלחה מחזור השכפול שלו heterokaryons ובכך פוסלים הגבלת הביטוי של גורמים דומיננטיים אלה שורות תאים. אלה מותנים השלמה הרומן חוצה שיטות יהיה שימושי למסך פאנל גדול של שורות תאים תאים ראשוניים לביטוי של HCV ספציפיים הגורמים הדומיננטיים הגבלה.
Protocol
Discussion
אנו מציגים שתי שיטות להשרות היווצרות heterokaryon בתאים בתרבית ניתוח של מגבלות שליליים דומיננטיים המונעים שכפול HCV. באמצעות נהלים אלה הוצאנו את נוכחותו של גורם הביע constitutively או וירוס הנגרמת הדומיננטי שונים הכבד אי האנושי ב שורות תאים Murine כבד. Assay 1 מנתח בעיקר אם גורמים הגבלת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Takaji Wakita ו Jens בוך עבור JFH1 ומבודד J6CF, בהתאמה. כמו כן אנו מודים צ'ארלס רייס על הא-7.5 התאים נוגדנים 9E10, סטיבן Foung עבור E2 נוגדנים ספציפיים CBH-23, וכל חברי המחלקה לוירולוגיה ניסיוני, Twincore לקבלת הצעות ודיונים מועילות.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 41965-039 |
| L-glutamine | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 25030-024 |
| Non-essential amino acids | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11140-035 |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 |
| Fetal calf serum | PAA, Cölbe, Germany | A15151 |
| α-E2 (CBH23) | kindly provided by Steven Foung 10 | |
| ATP | Sigma, Steinheim, Germany | A2833-106 |
| Glutathione | Sigma, Steinheim, Germany | G4251-1G |
| Blasticidin | Invivo Gen, San Diego, USA | Ant-bl-1 |
| G418 (geneticin) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11811-064 |
| Polyethylene-glycol-1500 | Roche, Mannheim, Germany | 10783641001 |
| Paraformaldehyde | Roth, Karlsruhe, Germany | 0335.3 |
| Triton X-100 | Roth, Karlsruhe, Germany | 3051.2 |
| Goat serum | Sigma, Steinheim, Germany | G9023-5mL |
| α-NS5A (9E10) | Kindly provided by Charles Rice 7 | |
| DAPI (4′,6′- diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 |
| Alexa-Fluor 546 – goat anti-human IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A21089 |
| Alexa-Fluor 488 – goat anti-mouse IgG | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | A10680 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 |
| CellTracker CMTMR | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2927 |
| CellTracker CMFDA | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | C2925 |
| Fluoromount | Sigma, Steinheim, Germany | F4680-25ML |
| All other chemicals | Roth, Karlsruhe, Germany | |
| Cell culture materials | Sarstedt, Nümbrecht, Germany |
References
- Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells. J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).
- Kato, T. Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon. J. Virol. 79, 592-596 (2005).
- Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line. J. Virol. 78, 491-501 (2004).
- Date, T. Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells. J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).
- Chang, K. S. Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities. J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).
- Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).
- Lindenbach, B. D. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. Science. 309, 623-626 (2005).
- Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat. Med. 11, 791-796 (2005).
- Witteveldt, J. CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells. J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).
- Bitzegeio, J. Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors. PLoS Pathog. 6, e1000978 (2010).
- Lindemann, D., Goepfert, P. A. The foamy virus envelope glycoproteins. Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).
- Brohm, C. Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation. J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).
- Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles. J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).
- Koutsoudakis, G. Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses. J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).
- Frentzen, A. Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines. PLoS Pathog. 7, e1002029 (2011).
- Lindemann, D. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).
- Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).
