膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

1。タンパク質の発現このようなpTLN 11またはpSG01MX 12などのアフリカツメガエルの卵母細胞の発現に適したベクターに関心の膜タンパク質をクローニングする。最適化されたベクターには、両方の5'および3' アフリカツメガエル β-グロビン非翻訳領域11,12、ユニークな制限部位、および5'UTR 11日以前にあるRNAのプロモーターのサイトが含まれています。これらのコンポーネントは、それぞれ最適な卵母細胞で発現、mRNA合成およびmRNA合成の前にプラスミドの直線化、のために必要とされています。 2。システイン変異カイト-ドゥーリトルのプロットは、タンパク質のアミノ酸配列（ProtScale、ExPASy）13を用いて標的タンパク質の膜貫通ドメインを識別するために採用されている。データは、疎水性対シーケンス番号として表示されます。正の値を表示する残基が最も可能性の高い膜貫通ドメインに記載されています。システインに変異される膜貫通及び細胞外ドメインとの間の界面に位置する最も可能性の残基を決定するためにこのプロットを使用してください。膜貫通ドメインと細胞外領域のインタフェースはカイト – ドゥーリトルのプロットを使用して、完全な確信を持って予測することができない決定するとして、それはインタフェースにあると予測されている残基の範囲を調べることが重要です。タンパク質のこの領域はfluorophore.Duringコンフォメーション変化の予測動きのために選択され、蛍光体は、親水性と疎水性の環境との間で以上の水焼入れし、少ない水焼入れの環境の間で移動します。環境におけるこれらの予測の変化の各々は、蛍光強度の変化になります。 クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene社）は、単一の細胞外にアクセス可能なシステインの構造を生成するために使用されます。簡単に言えば、10 ×反応緩衝液5μL、5μL/ ngのプラスミドDNAの2μL、1.25μLを100 ng /μLフォワードおよびリバースプライマー、dNTPを（100 mm）の1μL、および蒸留の39.5μLのそれぞれを混在させる水。最後に、PfuTurbo DNAポリメラーゼ（ストラタジーン社製）の1μLを加える。このステップで使用されるプライマーは、目的の細胞外残基のシステイン変異を設計する必要があります。 プログラムは、次の仕様のサーマルサイクラー：95℃95℃30秒間のC 12〜18サイクル℃30秒、55℃で1分間、および68 ° Cキロバイトプラスミド長さ当たりの1分間1サイクル。アニーリング温度（55 ° C）は各プライマーの融解温度から直接計算されます。最後のステップは、反応が一晩で実行されている場合、4℃での温度を保持するためにプログラムすることができます。サイクル数は、突然変異によって異なります。複数のアミノ酸の挿入のための点突然変異、単一のアミノ酸の変化のための16サイクル、または18サイクルを12サイクルを使用してください。 反応混合物、ピペッティングにより混合し、1分間遠心する（6000回転）にDpnI（New England Biolabs社）の1μLを追加。 37℃で1時間インキュベート° Cの水浴中。 氷とインキュベート滅菌SOCメディア（20 mg / mlのトリプトン、5 mg / mLの酵母エキス、1 mg / mLの塩化ナトリウム、0.4 mg / mLの塩化カリウム、0.02 MのMg 2 +、0.02上で解凍トップ10エレクトロコンピテント細胞（インビトロジェン社）必要に応じ° Cまでで、37 Mのグルコース、ddH2O）。一定分量1.5 mLの遠心チューブに細胞を20μLと、細胞に消化されたDNAの1μLを加える。 、氷の水で細胞Porator（Life Technologies）を埋めるには4kΩの電圧ブースターで高速、そして抵抗するために、330μFに充電レートを静電容量を設定します。 ピペット細胞poratorキュベットに細胞/ DNA溶液20μL。セルPoratorにキュベットを置き、蓋を閉じて電源コードを接続し、正しいキュベットにダイヤルを回す。電圧が430になるまで充電し、"を"保持するために電源を設定します。腕やプレストリガーにダイヤルを回して。ポンという音がある場合は、エレクトロポレーションを再試行します。 キュベットから細胞をピペッティングし、SOC培地1.5mLにそれらを転送する。 37℃で1.5時間インキュベート℃で振盪しながら。 LB /アンピシリン寒天プレート（10 mg / mLのトリプトン、5 mg / mLの酵母エキス、10 mg / mLの塩化ナトリウム、15 mg / mLの寒天、のddH 2 Oおよび100 ng /μLのアンピシリンにSOC /セル溶液30μlを移し）。プレート上に細胞を広げ、37℃で一晩インキュベートする。 収穫シングルプレートからコロニーとLB /アンピシリン（10 mg / mLのトリプトン、5 mg / mLの酵母エキス、10 mg / mLのNaClを100 ng /μLのアンピシリンのddH 2 O）のメディアを含む5 mLの培養液に接種する。 37振る℃で16〜20時間。 Nucleospinプラスミドキット（マシュレ-ナーゲル）を使用してDNAのミニプレップを実行します。質的にアガロースゲル電気泳動によって製品を調べます。光度計2000C分光光度計（Thermo Scientific社）を用いてDNAの収量をQuantitiate。 DNAシーケンシングにより変異の挿入を確認してください。 <p class="jove_title"> 3。 mRNAの合成 37.0で1時間、5μL、適切なバッファーと制限酵素の1μL℃で50リットルの反応容量でDNA、プラスミドDNAのダイジェスト3μgのを線形化するハイピュアPCR産物精製キット（ロシュダイアグノスティックス）を使用して、ダイジェストのバイアルと渦の短時間に350μL結合バッファーを加える。それは製品RNAのグレードを作るguanidiniumisothiocyanateが含まれているので、このキットが使用されます。 コレクションチューブにスピンカラムを配置し、ダイジェストのDNA溶液をカラムにロードします。 20秒18,000 gで遠心し、フロースルー捨てます。 列に洗浄バッファーを500μLを加える。 18000グラムで20秒間遠心分離し、フロースルーを捨てる。 列に洗浄緩衝液200μLを加える。 30秒間遠心分離または列は18,000で、gの乾燥になるまでオートクレーブした1.5​​ mLの遠心チューブにスピンカラムをセットし、カラムにDEPC処理水50μLを加える。 18000 gで30秒間遠心分離して溶出する溶液3μLに0.5μgの、その結果、約15μLの溶出したDNAを濃縮する。 プラスミドDNA（SP6、T7）のプロモーター部位の配列にしたがって正しいmMessage mMachineキット（Ambion社）を選択します。 5μL1 NTP -キャップミックス、前のステップからの3μL線状化DNA、1μL転写バッファー、および適切なRNAポリメラーゼの1μLを追加。 37℃で1.5〜2時間インキュベート℃に降水量のために少なくとも30分間のキットからのLiCl 12.5μL、15μLDEPC水、ミックス簡単に（ボルテックスしない）、10秒間、11,000 gで遠心分離し、-20℃で保存を追加。 4〜プレクール遠心℃、降水量の後にフルスピードで少なくとも15分を遠心。 遠心分離後に茶色のペレットがチューブの下部に表示されるはずです。慎重に、完全に上清を除去し、-20℃に冷却し70パーセントRNAグレードのエタノールを150μLのフルスピードで5分間4℃で遠心する。 エッペンドルフVacufugeプラスに（1〜2分）簡単に乾燥、完全に上清を除き、DEPC水12μLで今白いペレットを溶解する。光度計2000C分光光度計（Thermo Scientific社）を用いてmRNAの収量をQuantitiate。 4。卵母細胞の除去このプロトコルは、WPIの動物実験使用の委員会によって承認されている。 操作の前に、カエルが手術中に嘔吐を防ぐために12時間絶食されるべきである。 水に溶解した0.5〜3.0グラムMS – 222のソリューションとなります。解決策は、pHが7.0から8.0になるまで重炭酸ナトリウムを追加。 MS – 222は、手術中にカエルのための麻酔薬として使用されます。 MS – 222の処理中にすべての回でニトリル手袋を着用し、化学物質のボンネットの下に溶液を調製することが重要です。 カエルの復原とつま先のピンチの反射を失うまでMS – 222溶液中で蛙を浸す。無反応を確認するには、カエルの足指をつまんで。 ぬれたおむつのパッドの吸収側の背側にカエルを置きます。これは、カエルの皮膚への損傷を避けることができます。カエルが手術中湿った保たれる必要があるとして、常に近くにカエルにぬれたペーパータオルをしてください。カエルの目が開いている場合、それは生理食塩水でそれらを湿らすることが重要です。カエルは覚醒の兆しを示している場合は、カエルに麻酔液を注ぐと、カエルが応答不能になるまで待ちます。手順を続ける前に、第2趾のピンチを実行します。 カエルの正中線の左または右のどちらかに小さい体腔切開を加えます。切開部は、その後の手術で両側を交互に行う必要があります。 カエルの外側に卵巣を持参し、卵巣を摘出する。カエルの皮膚に卵巣に触れないようにしてください。出血が発生した場合は出血が止まるまで、滅菌綿棒で圧力を適用する。 3.0から4.0エチコンVicryl縫合糸材料（ジョンソン＆ジョンソン）との結節縫合パターンを用いて切開を縫合。縫合する際、一度に結び目を結ぶとカエルの皮膚に触れないように手術器具を使用してください。別々に体腔と皮膚の層を縫合することも重要です。これは、 アフリカツメガエルの卵と卵母細胞の収穫（：参照のためのNIHのガイドラインと整合的であるhttp://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ）。 手術後、カエルは、少なくとも2ヶ月間の動作を受けなけれはならない。カエルは、その後の手術を受けるのに十分な健全性がある場合にも決定する必要があります。 6手術の最大は6 番目の手術している端末との各カエルに行うことができます。 5。卵母細胞のDefoculationとmRNAのインジェクション分離された卵巣の葉は、小さな部分にハサミで分割されています。塊は、リンゲル液+コラゲナーゼ（8.6のCa 2 +に転送されますG / LのNaCl、0.3 g / Lの塩化カリウム、0.33 g / LのCaCl 2で ）。 ゆっくりと18℃で2時間のダイジェストソリューションを振るのCa 2 +（8.6 g / Lの塩化ナトリウムと0.3g / LのKCl） -ほとんどの卵母細胞を分離している場合は、リンゲル液で卵母細胞を洗う。リンゲル溶液で10分間卵母細胞をインキュベートする-のCa 2 +。 リンゲル液+のCa 2 +に卵母細胞を移す。 3.5"ドラモンドキャピラリーチューブで、Nanoject IIオートナノリッターインジェクター（ドラモンド）50 NLの最終容量には、mRNAの25 ngで卵母細胞を注入注：。mRNAの量は、標的タンパク質に応じて異なります。 注入後は、リンゲル溶液（90 mMのNaCl、2mMの塩化カリウム、5mMのMOPS、2mMのCaCl 2で 、pH 7.4）で、18で1 mg / mLのゲンタマイシンで3-7日卵母細胞をインキュベート·ダーク8のC。 6。サイト固有の蛍光ラベリング測定前、ローディングバッファー（110 mMのNaCl、2.5mMのクエン酸ナトリウム、及び10mM MOPS pH7.4で/トリス）で45分と後のローディングバッファーで45分間インキュベートする卵母細胞（100mMのNaCl、1mMのCaCl 2、へ5mMのBaCl 2、5mMのNiCl 2、および10mM MOPS pH7.4で/トリス）細胞内のNa +濃度14を増加させる。 蛍光測定のため、希望する蛍光体[EXの5μMを含む後のローディングバッファーでインキュベート卵母細胞。テトラメチルローダミン- 6 -マレイミド（TMRM）またはフルオレセイン-5 – マレイミド（FM）] 5〜10分間。フルオロフォア標識後、色素フリー後のローディングバッファー3で徹底的に卵母細胞を洗う。 7。電気生理学マイクロピペットプラー（モデルPC – 10、ナリシゲ）を使用してホウケイ酸毛細血管（1B150F – 4、世界の精密機器を）引いて、微小電極を行います。 3 M KClで電極を記入し、抵抗をテストします。抵抗はMΩ15 0.5から1.5の間でなければなりません。 535DF50励起フィルター、565 EFLPエミッションフィルタ、およびシステインスキャン実験用の570DRLPダイクロイックミラー（オメガオプティカル）と蛍光顕微鏡（カールツァイス、アクシオ審査蛍光顕微鏡）を装備。 蛍光顕微鏡のステージ上でRC – 10室（ワーナーインスツルメンツ）で卵母細胞を置き、静かに卵母細胞に製造された電極を挿入する。ターボテック- 05Xアンプ（NPIエレクトロニクス）を使用して、一定の値に膜電位を保持し、膜に続くソリューションの交換を越えたり、膜電位を変えることによりイオンフラックスを測定する。同時蛍光測定では、蛍光強度の変化を検出するためにドナーフルオロフォアとPIN – 022Aフォトダイオードを（ユナイテッド検出技術）励起する100 Wのタングステン光源を使用してください。アンプとダイオードの両方は、データ収集と記録のためのpCLAMP10ソフトウェア（アクソンインスツルメンツ）を利用するコンピュータとDigidata 1440Aデータ収集システム（アクソンインスツルメンツ）を介して、インターフェースです。 システインスキャンのために、pCLAMP 10ソフトウェア（Molecular Devices社）によって制御される定常電流による電圧のステップで蛍光強度の変化を測定する。興味の膜タンパク質に応じて、細胞外溶液は定常電流を確保するために設計されています。 標的タンパク質の機能的な測定に蛍光強度の変化を相関させる。 8。異方性の測定と距離の制約の決定。 異方性の測定は、κ2つの値の範囲を計算するために、距離測定8と一緒に注意してください。異方性は回転16から起因する蛍光体の相対移動度を測定します。偏光フィルター（リノスフォトニクス社製）を用いて、FMまたは関心のアミノ酸残基の偏光とTMRM以下の励起によって放出された平行および垂直光を測定する。測定は、溶液交 ​​換の条件8およびフルオロフォアの移動性を決定するために一定の膜電位の下で撮影されています。 異方性はrによって与えられる=（I | | – I⊥）/（I | | + 2I⊥）ここでI | |平行光が放射されていると私は⊥垂直の光は16を放出しています。距離測定の誤差を計算するには、κ 最大 2 = 2 / 3（1 + F RD + F RA + 3F RD * F RA）とκ2 分 = 2 / 3（1 – （F RD + F RA）/ 2 ）ここで、F RD =（R D / R O）0.5、F RA =（R A / R O）0.5; R TMRMの異方性であり、R d は FMの異方性であり、そしてR Oは、それぞれの蛍光体8の根本的な異方性です。 。 距離の制約を測定するために、ふたつのアクセス可能な細胞外のシステイン残を持つホロ酵素を使用してくださいUES。卵母細胞が測定中一定の膜電位、したがって、一定の距離で開催されるように、タンパク質の構造状態の関数としての蛍光変化が存在する必要はありません。 1μMFM（アクセプターフルオロフォア）と暗所で氷上で30分間4μMのTMRM（ドナー蛍光団）、またはわずか1μMFMを含む記事のローディングバッファーで卵母細胞をインキュベートする。これは、蛍光団8とし、アクセプターなしのラベルが付いたholoenzymesのために作られるために測定することができます。 475DF40励起フィルター付き顕微鏡、530DF30発光フィルター、および505DRLPダイクロイックミラーを装備。 アクセプターの蛍光団の存在下および非存在下で漂白ドナーの時間依存性を測定します。これらの測定値の時間的経過の間に、溶液流は連続でなければなりません。そうでなければ、時間の経過とともに蛍光の増加を誘導発熱が観察されることがあります。アクセプターの蛍光団がある場合とない場合の光破壊の違いは、2つの残基間の距離を計算するために使用されます。唯一のドナーフルオロフォアを含むHoloenzymesは、アクセプターフルオロフォアでholoenzymesよりも速い光破壊率が発生します。ときに、互いに8に近接してドナーとアクセプターフルオロフォアの両方を含むHoloyenzymesは遅い光破壊率を示すであろう。 平均は、pClamp10でClampexの機能を4卵母細胞の録音の最小のためのドナーフルオロフォアの光破壊の結果使用した。 結果が平均されると、ベストフィットの曲線を得るために指数関数を（monoexponential、biexponential）を使用します。ベストフィットの曲線は、アクセプターがある場合とない場合のドナーフルオロフォアの光破壊のための時定数を決定するために使用することができます。 GDAは、ドナー/アクセプターフルオロフォアのペアとΓDの時定数を参照しているE = 1 -ΓDA /ΓD 17、式で与えられるエネルギー伝達の効率を決定するには、唯一のドナーフルオロフォアの時定数を指します。 フェルスターequation17、E = 1 /（1 + R 6 / R O 6）を用いて 、標識されたシステイン残基間の距離を決定することができます。Eは、FRETの効率は、Rは、ドナーとアクセプターの蛍光団間の距離であり、そしてR oはです17ペアリング、ドナーとアクセプターの50％の効率の距離。 R oが方程式によって支配されているR O =（9.7×10 3JΦD nの -4κ2）ここで、Jは、ドナーの発光とアクセプタの吸収の正規化スペクトルの重複である、ΦDアクセプターフルオロフォアのないドナーの発光の量子収率であり、 nは屈折率であり、κ2は双極子-双極子相互作用の8方向の要因です。 9。タンパク質サブユニットの相対的な運動アクセプターとドナーの蛍光色素で標識されている二重システインの構文を使用してください。これらの実験では、2つのシステイン残基間距離の変化が測定されます。これが事実であるので、各残基の蛍光強度は、次の標識は、タンパク質8の立体配座の状態から独立している必要があります。このように、蛍光共鳴エネルギー移動の変化は、ドナーとアクセプターの蛍光団間の距離の変化の結果になります。 475AF40励起フィルター、595AF60エミッションフィルタと505DRLPダイクロイックミラー付顕微鏡を装備。これらの実験のために、ドナーが励起され、アクセプターフルオロフォアの蛍光が測定されます。膜タンパク質を活性化し、同時に蛍光強度の変化を測定する適切な方法（電圧、リガンド、ソリューションの交換）を使用してください。蛍光強度の増加は、2つのフルオロフォアとこのように、2つの残基が近接して移動していることが示されます。蛍光強度の減少は、2つのフルオロフォアとこのように、2つの残基が離れてさらに移動していることが示されます。最後に、蛍光強度の変化は2つのフルオロフォアとこのように、2つの残基がタンパク質のコンフォメーションの変化に応じて同じ距離にあることが示されません。 10。代表的な結果特定の蛍光物質で、細胞外のシステイン残基にラベルを付けると、コンフォメーション変化に応じて膜タンパク質の動きの調査を可能にします。典型的な電圧クランプ蛍光トレースを図1に示されています。少ない水焼入れの環境に、より疎水性の環境に、より親水性から以上の水焼入れから蛍光体の動きである蛍光強度の変化（下のトレース）、、溶液交換時にタンパク質のコンフォメーション変化（上からの結果トレース）。 この技術はエクステンすることができます二つの残基間の距離の制約を決定するためにDED。このような実験結果を図2に示されています。アクセプタflurophore（赤）の存在下では、光退色はアクセプターフルオロフォア（ブラック）を使用しない場合よりも遅い速度で発生します。退色の速度は直接フェルスターの式17に従って2つの蛍光団間の距離に関連しています。タンデムで行わつの電極電圧クランプ実験によって検証としてこのような結果は、蛋白質の異なる構造状態に関連付けることができます。 図1イオンの輸送と蛍光強度の変化の代表記録。のNa +、試験溶液とK +、10μM及び10mMのウアバイン存在下での試験溶液の存在下でトップ、電流クランプ測定。底、電流クランプ測定3,8,19と並行して測定した蛍光強度の変化。 退色の図2。経時変化。ドナーの光破壊がないこと（黒）とアクセプターフルオロフォア（赤）の存在下で測定されます。各トレースは、4卵母細胞の録音の平均値です。