L'examen de la dynamique conformationnelle des protéines membranaires In situ Avec site-dirigé marquage fluorescent

1. Expression de la protéine Clone de la protéine membranaire d'intérêt dans un vecteur approprié pour l'expression de Xenopus laevis ovocyte tels que pTLN 11 ou 12 pSG01MX. Optimisé vecteurs contiennent à la fois 5 'et 3' Xenopus laevis β-globine régions non traduites 11,12, un site de restriction unique, et un site promoteur d'ARN située avant la 5 'UTR 11. Ces composants sont nécessaires pour une expression optimale dans les ovocytes, la linéarisation du plasmide avant la synthèse de l'ARNm et la synthèse d'ARNm, respectivement. 2. Mutation cystéine Une parcelle de Kyte-Doolittle est employée pour identifier les domaines transmembranaires de la protéine ciblée en utilisant la séquence de la protéine acide aminé (ProtScale, ExPASy) 13. Les données sont affichées sous hydrophobicité vs numéro de séquence. Résidus qui affichent des valeurs positives sont les plus susceptibles trouve dans le domaine transmembranaire. Utilisez ce complot afin de déterminer les résidus les plus probables situées à l'interface entre les domaines transmembranaires et extracellulaires qui sera muté à la cystéine. Comme la détermination de l'interface du domaine transmembranaire et la région extracellulaire ne peut pas être prédit avec certitude complète en utilisant le tracé de Kyte-Doolittle, il est important d'examiner un éventail de résidus qui sont prévus pour être à l'interface. Cette région de la protéine est sélectionnée pour le mouvement prévu du fluorophore.During un changement de conformation, le fluorophore se déplacer entre un environnement hydrophile et hydrophobe, ou entre une trempe plus d'eau et moins l'environnement trempe à l'eau. Chacun de ces changements prévus dans l'environnement se traduira par un changement dans l'intensité de fluorescence. QuickChange mutagenèse dirigée Kit (Stratagene) est utilisé pour générer des constructions simples cystéine extracellulaire accessibles. En bref, mélanger 5 uL de tampon de réaction 10X, 2 pl de 5 ng / uL d'ADN plasmidique, 1,25 uL chacun de 100 ng / uL avant et arrière d'apprêt, 1 ul de dNTP (100 mM), et 39,5 ul de bidistillée de l'eau. Enfin, ajoutez 1 pl de l'ADN polymérase PfuTurbo (Stratagene). Les amorces utilisées pour cette étape devrait être conçu avec la mutation d'un résidu cystéine à extracellulaires d'intérêt. Programmer un thermocycleur aux spécifications suivantes: 1 cycle à 95 ° C pendant 30 secondes, 12-18 cycles à 95 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 1 minute et 68 ° C pendant 1 minute par kb de longueur plasmide. La température de recuit (55 ° C) est calculé directement à partir de la température de fusion de chaque amorce. Une dernière étape peut être programmé pour maintenir la température à 4 ° C si la réaction est effectuée pendant la nuit. Le nombre de cycles dépend de la mutation. Utilisez 12 cycles pour les mutations ponctuelles, 16 cycles pour un changement d'acide aminé unique, ou 18 cycles pour plusieurs insertions d'acides aminés. Ajouter 1 ul de Dpnl (New England Biolabs) au mélange réactionnel, mélanger par pipetage, et centrifuger (6000 rpm) pendant 1 minute. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C au bain-marie. Dégel top 10 des cellules électro-compétentes (Invitrogen) sur la glace et incuber stériles SOC médias (20 mg / ml de tryptone, extrait de levure 5 mg / ml, 1 mg / ml de NaCl, 0,4 mg / mL de KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 M de glucose, ddH2O) à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Aliquote de 20 uL de cellules dans des tubes de 1,5 ml à centrifuger et ajouter 1 uL d'ADN digéré pour les cellules. Remplissez le Cell-Porator (Life Technologies) avec de l'eau glacée, mettre la capacité à 330 uF, le taux de charge de jeûner, et la résistance à la tension-Booster à 4 kQ. Pipeter 20 ul de la solution de cellules / ADN dans les cellules porator cuvettes. Placer les cuvettes dans le Cell-Porator, fermez le couvercle, branchez le cordon d'alimentation, et tournez la molette dans la cuvette correcte. Régler l'alimentation de charge et maintenir le «haut» jusqu'à ce que la tension de lit 430. Tournez la molette pour armer et déclencher presse. S'il ya un bruit sec, recommencez l'électroporation. Pipeter les cellules de la cuvette et les transférer à 1,5 ml de SOC médias. Incuber pendant 1,5 heures à 37 ° C avec agitation. Transfert 30 uL de la solution SOC / cellule à LB / ampicilline gélose (10 mg / ml de tryptone, extrait de levure 5 mg / mL, 10 mg / ml de NaCl, 15 mg / mL de gélose, DDH 2 O et 100 ng / uL ampicilline ). Fais les cellules sur la plaque et incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit. Colonies seule récolte des plaques et ensemencer des cultures 5 ml contenant LB / ampicilline (10 mg / ml de tryptone, extrait de levure 5 mg / mL, 10 mg / ml de NaCl, 100 ng / uL ampicilline ddH 2 O) des médias. Agiter à 37 ° C pendant 16-20 heures. Effectuer une miniprep ADN en utilisant la trousse de Nucleospin plasmidique (Macherey-Nagel). Qualitativement examiner le produit en gel d'agarose. Quantitiate le rendement de l'ADN en utilisant un spectrophotomètre Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Vérifiez l'insertion des mutations par séquençage d'ADN. <p class="Jove_title"> 3. synthèse de l'ARNm Pour linéariser l'ADN, de digérer 3 pg d'ADN plasmidique dans un volume de 50 L de réaction avec 5 tampons appropriées ul et 1 pl de l'enzyme de restriction pendant 1 heure à 37,0 ° C. Utilisation du kit de Haute-Pure PCR purification des produits (Roche Applied Science), ajouter 350 ul de tampon liant à la fiole de digérer et brièvement au vortex. Ce kit est utilisé car il contient guanidiniumisothiocyanate qui rend la note du produit ARN. Placez colonnes de centrifugation dans des tubes de collecte et de charger la colonne avec une solution d'ADN digérer. Centrifuger à 18000 g pendant 20 secondes et jetez accréditives. Ajouter 500 ul de tampon de lavage à la colonne. Centrifuger 20 secondes à 18 000 g et jetez les traverser. Ajouter 200 ul de tampon de lavage à la colonne. Centrifuger 30 secondes ou jusqu'à la colonne est à sec à 18 000 g. Placer la colonne spin dans une autoclave tube de 1,5 ml à centrifuger et ajouter 50 ul d'eau traitée au DEPC à la colonne. Eluer par centrifugation pendant 30 secondes à 18 000 g. Concentrer l'ADN élue à environ 15 pi qui se traduit par 0,5 pg en 3 uL de solution. Choisir le bon mMessage mMachine Kit (Ambion) selon la séquence du site promoteur de l'ADN plasmidique (SP6, T7). Ajouter 5 ul 1 NTP-bouchon mélanger, 3 uL d'ADN linéarisé de l'étape précédente, une mémoire tampon de transcription ul, et 1 ul d'ARN polymérase appropriée. Incuber pendant 1,5-2 heures à 37 ° C. Ajouter 12,5 ul de LiCl du kit, 15 uL d'eau DEPC, brièvement mélanger (ne pas vortexer), centrifuger à 11000 g pendant 10 secondes, et conserver à -20 ° C pendant au moins 30 minutes pour les précipitations. Pré-cool centrifugeuse à 4 ° C et centrifuger au moins 15 minutes à pleine vitesse après précipitation. Après centrifugation une pastille brune devrait être visible au fond du tube. Attentivement et complètement éliminer le surnageant et ajouter 150 ul d'éthanol à 70% de grade ARN refroidi à -20 ° C. Centrifuger à 4 ° C pendant 5 minutes à pleine vitesse. Retirer le surnageant complètement, brièvement secs (1-2 min) dans une plus Eppendorf Vacufuge, et dissoudre le culot blanc aujourd'hui dans 12 uL d'eau DEPC. Quantitiate le rendement de l'ARNm en utilisant un spectrophotomètre Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). 4. Retrait ovocytes Ce protocole a été approuvé par les soins des animaux de WPI institutionnel et le Comité d'utilisation. Avant l'exploitation, la grenouille doit être à jeun pendant 12 heures pour éviter les vomissements pendant la chirurgie. Faire une solution de 0.5 à 3,0 g MS-222 dissous dans l'eau. Ajouter le bicarbonate de sodium jusqu'à ce que la solution a un pH 7,0-8,0. MS-222 est utilisé comme anesthésique pour la grenouille pendant la chirurgie. Il est important de porter des gants en nitrile, en tout temps pendant la manipulation du MS-222 et de préparer la solution sous une hotte chimique Plonger la grenouille dans la solution de MS-222 jusqu'à ce que la grenouille a perdu de redressement et des réflexes pincement de l'orteil. Pour vérifier insensibilité, pincer le bout de la grenouille. Placez la grenouille sur la face dorsale du côté absorbant d'un pavé mouillé sa couche. Cela évite d'endommager la peau de la grenouille. Gardez un papier mouillé une serviette à la grenouille à tout moment, comme la grenouille doit être maintenu humide tout au long de la chirurgie. Si les yeux de la grenouille sont ouvertes, il est important de les humidifier avec une solution saline. Si la grenouille montre des signes de réveil, versez la solution anesthésique sur la grenouille et attendre la grenouille devient insensible. Effectuer une pincée deuxième orteil avant de continuer la procédure. Faire une petite incision coelomique soit à la gauche ou à droite de la ligne médiane de la grenouille. Les incisions doivent être faites sur l'alternance des côtés avec chirurgies ultérieures. Apportez de l'ovaire à l'extérieur de la grenouille et enlever les ovaires. Évitez de toucher les ovaires à la peau de la grenouille. En cas de saignement, appliquez une pression avec un Q-tip stérile, jusqu'à ce que le saignement cesse. Suture de l'incision utilisant un modèle de suture interrompue avec de 3,0 à 4,0 matériels de suture Vicryl Ethicon (Johnson & Johnson). Lorsque suture, l'utilisation des instruments chirurgicaux pour attacher un noeud à la fois et éviter de toucher la peau de la grenouille. Il est également important de suturer le coelomique et couches de la peau séparément. Ceci est cohérent avec les directives du NIH pour la récolte d'oeufs et d'ovocytes en xénope (voir: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). Après la chirurgie, la grenouille ne doit pas subir l'exploitation pendant au moins 2 mois. Il convient également de déterminer si la grenouille est assez sain pour subir des interventions chirurgicales ultérieures. Un maximum de 6 chirurgies peuvent être effectuées sur chaque grenouille avec le terminal la chirurgie 6 ème être. 5. Defoculation ovocytes et d'injection de l'ARNm Le lobe de l'ovaire est divisé isolés avec des ciseaux en parties plus petites. Les massifs sont transférés dans une solution de Ringer + Ca 2 + avec de la collagénase (8,6g / L de NaCl, 0,3 g / L de KCl, et 0,33 g / L de CaCl 2). Secouez la solution de digestion pendant 2 heures à 18 ° C. Si la plupart des ovocytes sont séparés, se laver les ovocytes avec la solution de Ringer – Ca 2 + (8,6 g / L de NaCl et 0,3 g / L de KCl). Incuber ovocytes pendant dix minutes dans une solution de Ringer – Ca 2 +. Transfert des ovocytes à la solution de Ringer + Ca 2 +. Injecter des ovocytes avec 25 ng d'ARNm, dans un volume final de 50 nL avec les Nanoject II Auto-injecteur nanolitres (Drummond), avec 3,5 "tubes capillaires Drummond. Remarque: La quantité d'ARNm varie en fonction de la protéine cible. Après l'injection, les ovocytes incuber 3-7 jours dans la solution de Ringer (90 mM NaCl, 2 mM de KCl, 5 mM MOPS, 2 mM de CaCl2, pH 7,4) et 1 mg / ml de gentamycine à 18 ° C dans les 8 foncé. 6. Spécifiques au site marquage fluorescent Avant la mesure, incuber pendant 45 min ovocytes dans le tampon de chargement (110 mM NaCl, 2,5 mM citrate de sodium, et 10 mM MOPS / Tris à pH 7,4) et 45 min dans l'après-tampon de chargement (100 mM NaCl, 1 mM de CaCl2, 5 mm 2 BaCl, 5 mM NiCl 2, et 10 mM MOPS / Tris à pH 7,4) pour augmenter la concentration intracellulaire de Na + 14. Pour des mesures de fluorescence, les ovocytes incuber dans un tampon de post-chargement qui contient 5 uM du fluorophore désiré [ex. tétraméthylrhodamine-6-maléimide (TMRM) ou la fluorescéine-5-maléimide (FM)] pendant 5-10 minutes. Après l'étiquetage fluorophore, laver les ovocytes exhaustive sans colorant après-tampon de chargement 3. 7. Électrophysiologie Faire microélectrodes en tirant borosilicate capillaires (1B150F-4, Instruments de précision du monde) en utilisant un extracteur micropipette (modèle PC-10, Narishige). Remplir les électrodes avec 3 M de KCl et de tester la résistance. La résistance doit être comprise entre de 0,5 à 1,5 MQ 15. Équipé du microscope à fluorescence (Carl Zeiss, Axio Examiner fluorescence Microscope) avec un filtre 535DF50 excitation, un filtre d'émission 565 EFLP, et un miroir dichroïque 570DRLP (Omega Optical) pour les expériences de la cystéine à balayage. Placez l'ovocyte dans une chambre de RC-10 (Warner Instruments) sur la platine du microscope à fluorescence et insérer délicatement les électrodes fabriquées dans l'ovocyte. L'utilisation d'un Turbo Tec-05X amplificateur (NPI Electronics), maintenez le potentiel de membrane à une valeur constante et de mesurer le flux des ions à travers l'échange solution membranaire suivantes ou en changeant le potentiel membranaire. Pour simultanée des mesures de fluorescence, l'utilisation d'une source 100 W lumière au tungstène pour exciter le fluorophore donneur et une photodiode PIN-022A (technologies de détection-Unis) pour détecter les changements d'intensité de fluorescence. Tant l'amplificateur et photodiode sont interfacés via un système d'acquisition de données Digidata 1440A (Axon Instruments), avec un ordinateur utilisant le logiciel pCLAMP10 (Axon Instruments) pour l'acquisition de données et l'enregistrement. Pour la numérisation de cystéine, de mesurer le changement dans l'intensité de fluorescence à l'arrêt en cours échelons de tension à l'aide qui sont contrôlés par le logiciel pClamp 10 (Molecular Devices). Selon la protéine membranaire d'intérêt, la solution extracellulaire est conçu pour assurer actuelle stationnaire. Corrélation entre les changements d'intensité de fluorescence aux mesures fonctionnelle de la protéine ciblée. 8. Mesures d'anisotropie et détermination des contraintes de distance. Mesures d'anisotropie doit être prise aux côtés de huit mesures de distance pour calculer la gamme de κ 2 valeurs. Anisotropie des mesures de la relative mobilité du fluorophore due à la rotation 16. L'utilisation de filtres polarisés (Linos Photonics Inc), mesurer la lumière parallèles et perpendiculaires émise par FM ou TMRM excitation suivante avec une lumière polarisée au niveau des résidus d'acides aminés d'intérêt. Les mesures sont prises dans des conditions d'échange et de solution de 8 potentiel membranaire constante pour déterminer la mobilité des fluorophores. L'anisotropie est donnée par r = (I | |-I ⊥) / (I | | + 2I ⊥) où je | | est la lumière émise en parallèle et je ⊥ est la lumière émise perpendiculairement 16. Pour calculer l'erreur de mesure de distance, κ 2 max = 2 / 3 (1 + F + F ra rd + 3F rd * F ra) et κ 2 min = 2 / 3 (1 – (F + F ra rd) / 2 ) où F e = (r D / R o) 0,5 et F ra = (r / r o) 0,5; Ra est l'anisotropie de TMRM, r d est l'anisotropie de la FM, et r o est anisotropie fondamentale de chaque fluorophore 8 . Pour mesurer les contraintes de distance, utilisez une holoenzyme qui a deux résid accessibles cystéine extracellulaireUES. Comme les ovocytes aura lieu à un potentiel de membrane et de la distance constante donc constante pendant les mesures, il n'a pas besoin d'être un changement de fluorescence en fonction de l'état conformationnel de la protéine. Incuber les ovocytes dans le tampon de chargement après contenant 1 uM (accepteur fluorophore) FM et 4 TMRM uM (fluorophore donneur) pendant 30 minutes sur la glace dans l'obscurité, ou seulement 1 uM FM. Cela permet pour les mesures à prendre pour holoenzymes étiquetés avec et sans fluorophore accepteur 8. Équipé du microscope avec un 475DF40 d'excitation, le filtre d'émission 530DF30 filtre, et 505DRLP miroir dichroïque. Mesurer la dépendance temporelle des bailleurs de blanchiment dans la présence et l'absence de fluorophore accepteur. Pendant le cours du temps de ces mesures, le flux de solution doit être continu. Sinon, une chaleur de fluorescence induite augmenter au fil du temps peuvent être observés. La différence de photodestruction avec et sans le fluorophore accepteur est utilisée pour calculer la distance entre les deux résidus. Holoenzymes ne contenant que le fluorophore donneur connaîtra un rythme plus rapide que photodestruction holoenzymes avec un fluorophore accepteur. Holoyenzymes contenant à la fois un donneur et fluorophore accepteur exposera taux photodestruction lente quand à proximité de l'autre 8. Utilisation de la fonction de Clampex pClamp10, la moyenne des résultats de l'photodestruction du fluorophore donneur pour un minimum de quatre enregistrements ovocyte. Une fois les résultats ont été en moyenne, l'utilisation d'une fonction exponentielle (monoexponentielle, biexponentielle) pour obtenir une courbe de meilleur ajustement. La courbe de meilleur ajustement peut être utilisée pour déterminer la constante de temps pour la photodestruction du fluorophore donneur avec et sans l'accepteur. Déterminer l'efficacité du transfert d'énergie donnée par l'équation E = 1-Γ DA / Γ D 17, où GDA se réfère à la constante de temps pour la paire fluorophore donneur / accepteur et Γ D se réfère à la constante de temps pour que le fluorophore donneur. Utilisation de la Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), la distance entre les résidus cystéine étiqueté peut être déterminée; E est le FRET efficacité, R est la distance entre le donneur et fluorophore accepteur, et R o est la distance d'efficacité de 50% pour le donneur et accepteur d'appariement 17. R o est régie par l'équation R = o (3 9.7×10 JΦ D n -4 κ 2) où J est le chevauchement normalisée spectrale d'émission du donneur et d'absorption accepteur, Φ D est le rendement quantique d'émission de donneur sans un fluorophore accepteur, n est l'indice de réfraction, et κ 2 est le facteur d'orientation pour les interactions dipôle-dipôle 8. 9. Mouvement relatif des sous-unités protéiques Utilisez les constructions à double cystéine qui sont marqués avec des fluorophores accepteur et donneur. Pour ces expériences, le changement de distance entre les deux résidus cystéine seront mesurés. Puisque c'est le cas, l'étiquetage d'intensité de fluorescence qui suit à chaque résidu devrait être indépendant de l'état conformationnel de la protéine 8. Ainsi, tout changement dans le transfert d'énergie par résonance de fluorescence sera le résultat d'un changement de distance entre le donneur et le fluorophores accepteurs. Équipé du microscope avec un 475AF40 d'excitation, le filtre d'émission 595AF60 filtre et 505DRLP miroir dichroïque. Pour ces expériences, le donneur est excité et la fluorescence du fluorophore accepteur est mesurée. Utilisez la méthode appropriée (tension, un ligand, solution d'échange) pour activer la protéine de la membrane et de mesurer simultanément la variation d'intensité de fluorescence. Une augmentation de l'intensité de fluorescence indique que les deux fluorophores et donc deux résidus se rapprochent. Une diminution de l'intensité de fluorescence indique que les deux fluorophores et donc deux résidus se déplacent plus espacés. Enfin, aucun changement dans l'intensité de fluorescence indique que les deux fluorophores et donc deux résidus sont à la même distance sur le changement de conformation de la protéine. 10. Les résultats représentatifs Étiquetage des résidus cystéine extracellulaire avec des fluorophores spécifiques permet à l'enquête sur le mouvement des protéines de la membrane lors de changements de conformation. Une trace de tension typiques pince fluorométrie est montré dans la figure 1. Le changement dans l'intensité de fluorescence (trace inférieure), qui est le mouvement du fluorophore à partir d'un plus hydrophile à un environnement hydrophobe plus ou d'une trempe plus d'eau pour l'environnement moins d'eau de trempe, les résultats d'un changement conformationnel de la protéine à la solution d'échange (supérieure traces). Cette technique peut être extensionDED pour déterminer les contraintes de distance entre deux résidus. Ces résultats expérimentaux sont présentés dans la figure 2. En présence d'un accepteur de flurophore (rouge), photoblanchiment survient à un rythme plus lent que sans un fluorophore accepteur (noir). Le taux de photoblanchiment est directement liée à la distance entre deux fluorophores selon l'équation de Förster 17. Ces résultats peuvent être corrélés aux différents états conformationnels de la protéine tel que vérifié par deux expériences d'électrode de tension pince réalisée en tandem. Figure 1. Enregistrement Représentant de transport des ions et des changements dans l'intensité de fluorescence. Haut, les mesures de pince de courant en présence d'une solution de Na + test et la solution de test de K + en présence de 10 uM et 10 mM d'ouabaïne. Bas, les changements dans l'intensité de fluorescence mesurée en tandem avec des mesures de pince de courant 3,8,19. Figure 2. Dépendance temps de photoblanchiment. Photodestruction donateurs est mesuré en l'absence (en noir) et la présence de l'accepteur fluorophore (rouge). Chaque trace est la moyenne des quatre enregistrements ovocyte.