Examinando o Dynamics Conformacional de Proteínas de Membrana In situ Com Labeling-Site dirigido Fluorescência

1. Expressão da proteína Clone da proteína de membrana de interesse em um vetor apropriado para Xenopus laevis expressão oócito como pTLN 11 ou pSG01MX 12. Vetores otimizados contêm 5 'e 3' Xenopus laevis β-globina regiões não traduzidas 11,12, um sítio de restrição único, e um site promotor RNA localizado antes da 5 'UTR 11. Esses componentes são necessários para a expressão ideal em oócitos, linearização do plasmídeo antes da síntese do mRNA e síntese de mRNA, respectivamente. 2. Mutação cisteína A trama Kyte-Doolittle é empregada para identificar os domínios transmembrana da proteína alvo usando seqüência da proteína de aminoácidos (ProtScale, ExPASy) 13. Os dados são exibidos como hidrofobicidade versus número de seqüência. Resíduos que apresentam valores positivos são mais prováveis ​​encontradas no domínio transmembrana. Use este gráfico para determinar os resíduos mais provável localizado na interface entre os domínios transmembrana e extracelular, que será transformado em cisteína. Como determinar a interface do domínio transmembrana e região extracelular não pode ser previsto com certeza absoluta usando o enredo Kyte-Doolittle, é importante analisar uma série de resíduos que estão previstos para estar na interface. Esta região da proteína é selecionado para o movimento previsto da fluorophore.During uma mudança conformacional, o fluoróforo irá mover-se entre um ambiente hidrofílicas e hidrofóbicas ou entre um resfriamento mais água e ambiente menos quenching água. Cada uma dessas mudanças previstas no ambiente irá resultar em uma mudança na intensidade de fluorescência. QuickChange Site-Directed Mutagênese Kit (Stratagene) é usado para gerar única constrói cisteína extracelular acessível. Em resumo, mistura de 5 mL de tampão de reação 10X, 2 mL de 5 DNA ng / mL plasmídeo, 1,25 mL cada um dos 100 ng / mL frente e verso, primer, 1 mL de dNTP (100 mM), e 39,5 mL de bidestilada água. Por último, adicione 1 mL de PfuTurbo DNA polimerase (Stratagene). Os primers utilizados para esta etapa devem ser projetados com a mutação de um resíduo de cisteína extracelular de interesse. Programar um termociclador com as seguintes especificações: 1 ciclo a 95 ° C por 30 segundos, 12-18 ciclos de 95 ° C por 30 segundos, 55 ° C por 1 minuto e 68 ° C por 1 minuto por kb de comprimento plasmídeo. A temperatura de anelamento (55 ° C) é calculado diretamente da temperatura de fusão de cada primer. A etapa final pode ser programado para manter a temperatura a 4 ° C, se a reação é realizada durante a noite. O número de ciclos depende da mutação. Use 12 ciclos de mutações pontuais, 16 ciclos para uma mudança de um único aminoácido, ou 18 ciclos para múltiplas inserções de aminoácidos. Adicionar 1 mL de DpnI (New England Biolabs) para a mistura de reação, a mistura por pipetagem, e centrifugar (6000 rpm) por 1 minuto. Incubar por 1 hora a 37 ° C em banho-maria. Descongelar top 10 eletro-competentes células (Invitrogen) em gelo e estéril incubar SOC media (20 mg / ml triptona, extrato de levedura 5 mg / mL, 1 mg / mL de NaCl, 0,4 mg / mL KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 M de glicose, ddH2O) a 37 ° C até ser necessário. ML alíquota 20 de células em tubos de 1,5 mL de centrífuga e adicionar 1 mL de DNA digeridos para as células. Preencher a célula Porator (Life Technologies), com água gelada, definir a capacitância de 330 mF, a taxa de carga rápida, e resistência à tensão-Booster a 4 kW. Pipetar 20 mL da solução de célula / DNA na célula-porator cubetas. Coloque o cubetas para dentro da célula Porator, feche a tampa, conecte o cabo de alimentação, e gire o botão para a cubeta correta. Definir a fonte de alimentação para carregar e manter 'up' até que a tensão lê 430. Gire o botão para armar e disparar imprensa. Se houver um som de estalo, repita a eletroporação. Pipeta as células da cuvete e transferi-los para 1,5 mL de SOC mídia. Incubar durante 1,5 horas a 37 ° C com agitação. Transferência de 30 mL da solução SOC / célula para LB / ágar ampicilina (10 mg / mL triptona, extrato de levedura 5 mg / mL, 10 mg / mL de NaCl, 15 agar mg / mL, DDH 2 O e 100 ng / mL ampicilina ). Espalhe as células na placa e incubar a placa a 37 ° C durante a noite. Colônias única colheita das placas e inocular 5 culturas mL contendo LB / ampicilina (10 mg / mL triptona, extrato de levedura 5 mg / mL, 10 mg / mL de NaCl, 100 ng / mL ampicilina DDH 2 O) de mídia. Agite a 37 ° C durante 16-20 horas. Executar uma miniprep DNA usando o kit Nucleospin Plasmid (Macherey-Nagel). Qualitativamente examinar o produto por eletroforese em gel de agarose. Quantitiate o rendimento de DNA usando uma Nanodrop 2000c Espectrofotômetro (Thermo Scientific). Verificar a inserção de mutação pelo seqüenciamento de DNA. <p class="Jove_title"> 3. Síntese mRNA Para linearizar o DNA, digerir mg 3 de DNA plasmidial em 50 L volume de reação com 5 mL tampão apropriado e 1 mL da enzima de restrição por 1 hora a 37,0 ° C. Usando o Alto-Pure PCR Purification Kit do produto (Roche Applied Science), adicionar 350 mL de buffer de ligação para o frasco digerir e brevemente vortex. Este kit é usado, porque contém guanidiniumisothiocyanate que torna o produto grade RNA. Coloque as colunas giram em tubos de coleta e de carga a coluna com solução de digerir DNA. Centrifugar a 18.000 g por 20 segundos e descartar por escoamento. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem para a coluna. Centrífuga 20 segundos a 18.000 g e descarte fluir. Adicionar 200 mL de tampão de lavagem para a coluna. Centrífuga 30 segundos ou até coluna é seco, a 18.000 g. Coloque a coluna girar em um tubo de centrífuga autoclavado 1,5 mL e adicionar 50 mL de água tratada DEPC-à coluna. Eluir por centrifugação por 30 segundos a 18.000 g. Concentrar o DNA eluído para aproximadamente 15 mL o que resulta em 0,5 mg em 3 mL de solução. Escolha o correto mMessage mMachine Kit (Ambion) de acordo com a seqüência do site promotor no DNA plasmídeo (SP6, T7). Adicionar 5 mL um mix NTP-cap, 3 mL DNA linearizado da etapa anterior, um tampão de transcrição mL e 1 mL da RNA polimerase apropriado. Incubar por 1,5-2 horas a 37 ° C. Adicionar 12,5 mL de LiCl do kit, 15 mL de água DEPC, brevemente mix (não vortex), centrifugar a 11.000 g por 10 segundos, e armazenar a -20 ° C durante pelo menos 30 minutos para precipitação. Pré-cool centrífuga a 4 ° C e centrifugar pelo menos 15 minutos na velocidade máxima após precipitação. Após a centrifugação uma pelota marrom deve ser visível na parte inferior do tubo. Cuidadosamente e remover completamente o sobrenadante e adicionar 150 mL de 70% de etanol RNA grau resfriado a -20 ° C. Centrífuga a 4 ° C por 5 minutos na velocidade máxima. Retire o sobrenadante completamente, brevemente seca (1-2 min) em um Vacufuge Eppendorf Plus, e dissolver o sedimento branco agora em 12 mL de água DEPC. Quantitiate a produção de mRNA usando um Nanodrop 2000c Espectrofotômetro (Thermo Scientific). 4. Remoção de oócitos Este protocolo foi aprovado pelo WPI Cuidado Animal da Comissão Institucional e uso. Antes da operação, o sapo deve estar em jejum por 12 horas para evitar vômitos durante a cirurgia. Faça uma solução de 0,5-3,0 g MS-222 dissolvido em água. Adicionar bicarbonato de sódio até que a solução tem um pH 7,0-8,0. MS-222 é usado como anestésico para o sapo durante a cirurgia. É importante usar luvas de borracha nitrílica em todos os momentos durante o manuseio MS-222 e preparar a solução sob um capuz químico Mergulhe o sapo na solução MS-222 até o sapo perdeu corrigir e reflexos pitada dedo do pé. Para verificar a ausência de resposta, aperte o dedo do pé do sapo. Coloque o sapo no lado dorsal do lado absorvente de uma almofada de fralda molhada. Isso evita danos à pele da rã. Mantenha uma toalha molhada perto de papel para o sapo em todos os momentos, como o sapo deve ser mantido úmido durante toda a cirurgia. Se os olhos do sapo estão abertos, é importante para umedecê-los com soro fisiológico. Se o sapo mostra sinais de despertar, despeje a solução anestésica para o sapo e espere até que o sapo deixa de responder. Realizar uma pitada segundo dedo do pé antes de continuar o procedimento. Fazer uma pequena incisão coelomic para a esquerda ou direita da linha média do sapo. Incisões devem ser feitas em lados alternados com as cirurgias subseqüentes. Trazer o ovário para o exterior do sapo e remover o ovário. Evite tocar os ovários a pele do sapo. Se ocorrer sangramento, aplique pressão com um tip-Q estéril até que o sangramento pare. Suturar a incisão usando um padrão de sutura interrompido com 3,0-4,0 material de sutura Vicryl Ethicon (Johnson & Johnson). Quando sutura, use instrumentos cirúrgicos para amarrar um nó de cada vez e evite tocar a pele do sapo. Também é importante para a sutura do coelomic e camadas da pele separadamente. Isto é consistente com as Diretrizes do NIH para o ovo e colheita de ovócitos em Xenopus laevis (ver: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). Após a cirurgia, o sapo não devem ser submetidos a operação por pelo menos 2 meses. Também deve ser determinado se o sapo é saudável o suficiente para passar por cirurgias subseqüentes. Um máximo de 6 cirurgias podem ser realizadas em cada sapo com o terminal de cirurgia sendo 6 º. 5. Defoculation oócito e injeção de mRNA O lobo isolado de ovário é dividida com tesoura em partes menores. Os aglomerados são transferidos para Solução de Ringer + Ca 2 + com colagenase (8,6g / L NaCl, 0,3 g / L KCl, e 0,33 g / L CaCl 2). Agite suavemente a solução a analisar durante 2 horas a 18 ° C. Se a maioria dos oócitos são separados, lave oócitos com Solução de Ringer – Ca 2 + (8,6 g / L NaCl e 0,3 g / L KCl). Incubar oócitos por dez minutos em solução de Ringer – Ca 2 +. Transferência de oócitos para a Solução de Ringer + Ca 2 +. Injetar oócitos com 25 ng de mRNA, num volume final de 50 nL com o II Nanoject Auto-nanolitros Injector (Drummond), com 3,5 "tubos capilares Drummond. Nota: A quantidade de mRNA varia de acordo com a proteína alvo. Após a injeção, os oócitos incubar 3-7 dias em Solução de Ringer (90 mM NaCl, KCl 2 mM, 5 mM MOPS, 2 mM CaCl 2, pH 7,4) e 1 mg / mL de gentamicina a 18 ° C no escuro 8. 6. Site-specific Rotulagem de fluorescência Antes da medição, incubar oócitos por 45 minutos em tampão de carregamento (110 mM NaCl, 2,5 mM de citrato de sódio, e 10 mM MOPS / Tris, pH 7,4) e 45 min na pós-loading buffer (100 mM NaCl, CaCl 2 1 mM, 5 mM BaCl 2, 5 mM NiCl 2, e 10 mM MOPS / Tris, pH 7,4) para aumentar a concentração intracelular de Na + 14. Para medições de fluorescência, oócitos incubar em um buffer de pós-carregamento que contém 5 mM do fluoróforo desejado [ex. tetrametilrodamina-6-maleimida (TMRM) ou fluoresceína-5-maleimida (FM)] por 5-10 minutos. Após a marcação fluoróforo, lave os oócitos exaustivamente com corante livre de buffer de pós-carregamento-3. 7. Eletrofisiologia Faça microeletrodos puxando borosilicato capilares (1B150F-4, Instrumentos de Precisão Mundial) com um puxador de micropipeta (modelo PC-10, Narishige). Preencha os eletrodos com 3 M KCl e testar a resistência. A resistência deve estar entre 0,5-1,5 mohms 15. Equipar o microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Axio Examiner microscópio de fluorescência) com um filtro de excitação 535DF50, a 565 EFLP emissão de filtro, e uma 570DRLP espelho dicróico (Omega Optical) para experimentos cisteína digitalização. Coloque o oócito em uma câmara de RC-10 (Warner Instruments) no palco microscópio de fluorescência e suavemente os eléctrodos fabricados no citoplasma do ovócito. Usando um amplificador de Tec-05X Turbo (NPI Electronics), têm o potencial de membrana em um valor constante e medir o fluxo de íons através da solução de troca de membrana seguinte ou alterando o potencial de membrana. Para medições simultâneas de fluorescência, use uma fonte de 100 W de luz tungstênio para excitar o fluoróforo doador e um fotodiodo PIN-022A (Tecnologias Detector Unidos) para detectar mudanças na intensidade de fluorescência. Ambos os amplificadores e fotodiodo são interligados, através de um sistema de aquisição de Digidata 1440A dados (Axon Instruments), com um computador utilizando software pCLAMP10 (Axon Instruments) para aquisição de dados e gravação. Para a digitalização de cisteína, medir a mudança na intensidade de fluorescência estacionária na atual tensão usando passos que são controlados por software pCLAMP 10 (Dispositivos Molecular). Dependendo da proteína de membrana de interesse, a solução extracelular é projetado para assegurar corrente estacionária. Correlacionar mudanças na intensidade de fluorescência para medições funcionais da proteína alvo. 8. Medidas de anisotropia e Determinação das Restrições à Distância. Medições de anisotropia deve ser tomado junto com medições de distância de 8 a calcular a série de κ 2 valores. Anisotropia mede a mobilidade relativa do fluoróforo devido à rotação 16. Usando filtros polarizados (Linos Photonics Inc.), medir a luz paralela e perpendicular emitida por FM ou excitação TMRM seguinte com luz polarizada em resíduos de aminoácidos de interesse. As medições são realizadas em condições solução de troca 8 e potencial de membrana constante para determinar a mobilidade dos fluoróforos. Anisotropia é dada por r = (I | |-I ⊥) / (I | | + 2I ⊥) onde | | é a luz emitida em paralelo e eu ⊥ é a luz emitida perpendicular 16. Para calcular o erro em medições de distâncias, κ 2 max = 03/02 (1 + F + F º 3F + ra rd * F ra) e κ 2 min = 03/02 (1 – (F + F ª ra) / 2 ), onde F rd = (r d / r o) 0,5 e F ra = (r a / r o) 0,5; r é uma anisotropia de TMRM, r d é anisotropia do FM, e r é o anisotropia fundamentais de cada fluoróforo 8 . Para medir a distância restrições, use uma holoenzima, que tem duas resid cisteína acessíveis extracelularues. Como os oócitos será realizada em um potencial de membrana constante e, portanto, a distância constante durante as medições, não tem necessidade de ser uma mudança de fluorescência em função do estado conformacional da proteína. Incubar os oócitos em tampão pós carga contendo 1 mM FM (receptor fluoróforo) e 4 TMRM mM (fluoróforo doador) por 30 minutos no gelo, no escuro, ou apenas 1 mM FM. Isto permite que as medições sejam feitas para Holoenzimas rotulados com e sem um receptor fluoróforo 8. Equipar o microscópio com uma excitação 475DF40 filtro, 530DF30 emissão de filtro, e espelho 505DRLP dicróicas. Medir a dependência do tempo de branqueamento doador na presença e ausência do fluoróforo aceitador. Durante o curso do tempo destas medições, o fluxo de solução deve ser contínuo. Caso contrário, um aumento de fluorescência induzida por calor ao longo do tempo podem ser observadas. A diferença de photodestruction com e sem o fluoróforo aceitador é usado para calcular a distância entre os dois resíduos. Holoenzimas contendo apenas fluoróforo do doador irá experimentar uma taxa mais rápida do que photodestruction Holoenzimas com um fluoróforo aceitador. Holoyenzymes contendo um doador e aceitador fluoróforo exibirão taxas photodestruction lento quando na proximidade de um outro 8. Usando o recurso Clampex pClamp10 em média, os resultados da photodestruction de fluoróforo doador para um mínimo de quatro gravações ovócito. Uma vez que os resultados têm sido em média, use uma função exponencial (monoexponencial, biexponencial) para obter uma curva de melhor ajuste. A curva de melhor ajuste pode ser usado para determinar a constante de tempo para o photodestruction de fluoróforo doador com e sem o receptor. Determinar a eficiência de transferência de energia dada pela equação E = 1-Γ DA / Γ D 17, onde GDA refere-se a constante de tempo para o par de fluoróforo doador / receptor e Γ D refere-se a constante de tempo apenas para os doadores fluoróforo. Usando o Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), a distância entre resíduos de cisteína marcado pode ser determinado; E é o FRET eficiência, R é a distância entre doador e receptor fluoróforo, e R é o a distância 50% de eficiência para o doador e receptor emparelhamento 17. R o é governado pela equação R o = (9.7×10 3 JΦ D n -4 κ 2), onde J é a sobreposição espectral normalizada de emissão do doador e absorção aceitador, Φ D é o rendimento quântico de emissão do doador, sem um fluoróforo aceitador, n é o índice de refração, e κ 2 é o fator de orientação para as interações dipolo-dipolo 8. 9. Movimento relativo de subunidades da proteína Use constrói cisteína duplo que são rotulados com receptor e doador fluoróforos. Para estes experimentos, a alteração na distância entre os dois resíduos de cisteína será medido. Como este é o caso, a rotulagem seguintes fluorescência intensidade em cada resíduo deve ser independente do estado conformacional da proteína 8. Assim, qualquer mudança na transferência de energia de ressonância de fluorescência será o resultado de uma variação da distância entre o doador eo receptor fluoróforos. Equipar o microscópio com uma excitação 475AF40 filtro, filtro de emissão 595AF60 e espelho 505DRLP dicróicas. Para estes experimentos, o doador é animado ea fluorescência do fluoróforo aceitador é medido. Use o método apropriado (tensão, ligando solução, câmbio) para ativar a proteína de membrana e, simultaneamente, medir a mudança na intensidade de fluorescência. Um aumento na intensidade de fluorescência indica que os dois fluoróforos e, portanto, dois resíduos estão a aproximar. Uma diminuição na intensidade de fluorescência indica que os dois fluoróforos e, portanto, dois resíduos estão se movendo mais distantes. Finalmente, nenhuma mudança na intensidade de fluorescência indica que os dois fluoróforos e, portanto, dois resíduos estão na mesma distância com a mudança na conformação da proteína. 10. Resultados representante Rotulagem resíduos de cisteína extracelular com fluoróforos específicos permite a investigação do movimento de proteínas da membrana sobre mudanças conformacionais. Um típico traço de tensão fluorometria grampo é mostrado na Figura 1. A mudança na intensidade de fluorescência (traço inferior), que é o movimento do fluoróforo de um mais hidrofílico para um ambiente mais hidrofóbico ou de uma têmpera mais água para menos ambiente de água de têmpera, os resultados de uma mudança conformacional na proteína em solução de câmbio (superior traço). Esta técnica pode ser extended para determinar restrições de distância entre dois resíduos. Tais resultados experimentais são mostrados na Figura 2. Na presença de um aceitador flurophore (vermelho), fotodegradação ocorre em um ritmo mais lento do que sem um fluoróforo aceitador (preto). A taxa de fotodegradação está diretamente relacionada com a distância entre dois fluoróforos acordo com a equação Förster 17. Tais resultados podem ser correlacionados a diferentes estados conformacionais da proteína como verificado por dois eletrodos de voltagem clamp experimentos realizados em tandem. Figura 1. Gravação Representante do transporte de íons e mudanças na intensidade de fluorescência. Superior, atual medições braçadeira na presença de Na + solução de teste e solução de K + teste na presença de 10 mM e 10 mM ouabaína. Fundo, as mudanças na intensidade de fluorescência medidos em conjunto com medições braçadeira atual 3,8,19. Figura 2. Dependência do tempo de Fotodegradação. Photodestruction doador é medida na ausência (preto) e presença de aceitador fluoróforo (vermelho). Cada traço é a média de 4 gravações ovócito.