Summary

Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez

Published: December 26, 2010
doi:

Summary

Hem de özel transfekte hedef genlerin tek bir nükleotid yerine Oligonükleotidler sitesi için kullanılabilir<em> Anofel gambiae</em> Ve<em> Anofel stephensi</em> Hücreler.

Abstract

Sıtma parazitinin, sıtma etkeni, her yıl 250 milyon yeni enfeksiyon sonucu enfekte Anofel sivrisinek sokması ile bulaşır. Onlarca yıllık araştırma rağmen, sıtmaya karşı bir aşı roman kontrol stratejileri için gereğinin altını, hala orada. Bir yenilikçi bir yaklaşım etkili sıtma paraziti iletimini kontrol etmek için genetiği değiştirilmiş sivrisineklerin kullanılmasıdır. Parazit geliştirme 1 düzenlemek için kasıtlı olarak değişiklikler, hedef mutagenez üzerinden sivrisinek hücre sinyal yolları bulundu. Bu çalışmalarda, biz, dönüşüm için potansiyel gen hedefler belirlemeye başlayabilirsiniz. Hedeflenen mutagenez, geleneksel bir hedef gen ve büyük bir DNA molekülü arasındaki homolog rekombinasyon güvenerek vardır. Ancak, stabil bir şekilde dönüştürülmüş hücre hatları üretimi için bu tür karmaşık DNA molekülleri inşası ve kullanımı, pahalı, zaman alıcı ve genellikle verimsiz. Bu nedenle, kilitli nükleik asit modifiye oligonükleotidler (LNA-ons) kullanarak bir strateji episomal ve kromozomal DNA gen hedefleri (2) içine yapay tek nükleotid değiştirmelerin tanıtmak için yararlı bir alternatif sağlar. LNA-ON-aracılı hedef mutagenez, maya ve fareler 3,4 hem de kültür hücreleri ilgi genler nokta mutasyonları tanıtmak için kullanılır olmuştur . LNA-ons Anofel gambiae ve Anofel stephensi hücreleri hem de yeşil floresan protein (GFP) ifade mavi floresan protein (BFP) ifadesi bir anahtarı sonuçları transfekte episomal hedef tek bir nükleotid değişimi tanıtmak için kullanılabileceğini gösteriyor . Bu dönüşüm, sivrisinek hücreleri hedef genlerin etkili mutagenez LNA-ons aracılık ve bu tekniği, in vitro ve in vivo kromozomal hedefleri mutagenez için geçerli olabileceğini düşündürmektedir ki ilk kez gösteriyor.

Protocol

Protokol başlamadan önce, bu deneyde kullanılan sivrisinek hücreleri sağlıklı ve ~% 80 birleştiği noktada yer yapışık eğer (Şekil 1) olduğunu belirlemek önemlidir. Büyümüş ya da sağlıksız hücreleri düşük transfeksiyon verimlilik ve tutarsız sonuçlar verecektir. 30 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda kullanmak için önce tüm medya Isınma. MEM, Earle w / glutamin,% 5 ısı inaktive FCS,% 0.2 D-glukoz,% 1 penisilin-streptomisin antibiyotik ve% 1 non-esansiyel amino asi…

Discussion

Burada A. LNA-ons transfeksiyon aşağıdaki episomal bir gen hedef tek bir nükleotid hedeflenen dönüşüm için in vitro metod ve kanıtların bir mevcut stephensi ve A. gambiae hücreleri. LNA-ON-aracılı gen dönüşümü bir site-spesifik DNA onarım yanıt indüksiyon gerektirir; bizim veri sivrisinek hücreleri için bu siteye özgü mutagenez mekanizması destek olduğunu göstermektedir. Burada sunulan yöntem episomal bir hedef dönüşüm dayalı iken, bizim veri, diğer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz sitometrisi ile ona yardım için California Ulusal primat Araştırma Merkezi Abbie Spinner teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) AI073745, AI080799 ve AI078183 fon tarafından desteklenmiştir.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Effectene transfection reagent   Qiagen 301425  
GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)   Invitrogen K4935-00  
BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)   Gift from Dr. Concordet3    
LNA-ONs   Gift from Dr. Concordet3    
MEM, Earle’s w/ glutamine   Invitrogen 11095  
Fetal calf serum (FCS)   Invitrogen 16000  
Schneider’s Drosophila medium   Invitrogen 11730  
Non-essential amino acids   Invitrogen 11140  
10% D-glucose   Sigma G5767  
Penicillin-streptomycin antibiotic   Invitrogen 15140  
6-well culture plates   Corning 3516  

References

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pakpour, N., Cheung, K. W., Souvannaseng, L., Concordet, J., Luckhart, S. Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (46), e2355, doi:10.3791/2355 (2010).

View Video