Summary

ترنسفكأيشن والطفرات في الجينات المستهدفة في الخلايا عن طريق البعوض مغلق [أليغنوكليوتيد] حمض تعديل الأحماض النووية

Published: December 26, 2010
doi:

Summary

ويمكن استخدام [أليغنوكليوتيد] إلى موقع بديل على وجه التحديد النوكليوتيدات واحد من الجينات المستهدفة في كل من transfected<em> الأنوفيلة الغامبية</em> و<em> الأنوفيلة stephensi</em> الخلايا.

Abstract

وتنتقل الطفيليات المتصورة ، العامل المسبب للمرض الملاريا ، عن طريق لدغات البعوض المصابة الأنوفيلة الناتجة في أكثر من 250 مليون إصابة جديدة سنويا. رغم عقود من البحث ، وأنه لا يوجد لقاح ضد الملاريا ، وتسليط الضوء على الحاجة إلى استراتيجيات مكافحة الرواية. نهج واحد هو استخدام مبتكرة من البعوض المعدل وراثيا لمكافحة الملاريا بفعالية انتقال الطفيلي. تم العثور على التعديلات المتعمدة من مسارات إشارات الخلية في البعوض عن طريق الطفرات المستهدفة ، لتنظيم الطفيلي التنمية 1. من هذه الدراسات ، ويمكننا أن نبدأ في تحديد الأهداف المحتملة للتحول الجينات. وقد اعتمد الطفرات المستهدفة تقليديا على إعادة التركيب مثلي بين الجينات المستهدفة وجزيء DNA كبيرة. ومع ذلك ، وبناء واستخدام مثل هذه جزيئات الحمض النووي لتوليد معقدة من خطوط الخلايا تحولت ستابلي غير مكلفة ، وتستغرق وقتا طويلا وغير فعالة في كثير من الأحيان. ولذلك ، ووضع استراتيجية استخدام حمض النووي مؤمن المعدلة [أليغنوكليوتيد] (LNA فيرفكس) يوفر بديلا مفيدا لإدخال بدائل اصطناعية النوكليوتيدات واحد في episomal والكروموسومات الجينات أهداف الحمض النووي (التي استعرضت في 2). وقد استخدمت LNA – ON بوساطة الطفرات التي تستهدف إدخال طفرات الجينات في نقطة من الفائدة في خلايا الخميرة المثقف على حد سواء والفئران 3،4. نعرض هنا التي يمكن استخدامها LNA الإضافات إلى إدخال تغيير واحد في النوكليوتيدات استهداف episomal transfected أن النتائج في التحول من اللون الأزرق الفلورسنت التعبير (BFP) البروتينات الفلورية الخضراء إلى التعبير (GFP) البروتين في الأنوفيلة الغامبية على حد سواء والخلايا الأنوفيلة stephensi . يوضح هذا التحويل للمرة الأولى التي يمكن أن تكون الطفرات بوساطة فعالة من الجينات المستهدفة في الخلايا بواسطة البعوض LNA الإضافات ويشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن تنطبق على الطفرات الكروموسومية من الأهداف في المختبر والمجراة.

Protocol

قبل البدء في البروتوكول ، من المهم أن تقرر أن البعوض الخلايا التي استخدمت في التجربة ويتمتعون بصحة جيدة عند التقاء ~ 80 ٪ إذا كان ملتصق (الشكل 1) والخلايا متضخمة أو غير صحية نتيجة انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن وسوف تعطي نتائج غير متناسقة. <li style=";text-align:right;direct…

Discussion

نحن هنا في طريقة تقديم الأدلة والمختبر لتحويل المستهدفة من النوكليوتيدات واحد في الهدف الجين episomal التالية ترنسفكأيشن من LNA الإضافات إلى A. وألف stephensi خلايا الغامبية. LNA – ON بوساطة التحويل الجيني يتطلب استحثاث موقع محدد الحمض النووي ردا الإصلاح ؛ الب…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر آبي سبينر في المركز الوطني للبحوث الرئيسيات في كاليفورنيا للحصول على المساعدة لها مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة بتمويل من المعهد الوطني لأمراض الحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة الوطنية (NIH) AI073745 ، AI080799 وAI078183.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Effectene transfection reagent   Qiagen 301425  
GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)   Invitrogen K4935-00  
BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)   Gift from Dr. Concordet3    
LNA-ONs   Gift from Dr. Concordet3    
MEM, Earle’s w/ glutamine   Invitrogen 11095  
Fetal calf serum (FCS)   Invitrogen 16000  
Schneider’s Drosophila medium   Invitrogen 11730  
Non-essential amino acids   Invitrogen 11140  
10% D-glucose   Sigma G5767  
Penicillin-streptomycin antibiotic   Invitrogen 15140  
6-well culture plates   Corning 3516  

References

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pakpour, N., Cheung, K. W., Souvannaseng, L., Concordet, J., Luckhart, S. Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (46), e2355, doi:10.3791/2355 (2010).

View Video