Summary

Трансфекция и мутагенеза генов-мишеней в Mosquito ячейки путем Закрытые нуклеиновых кислот модифицированных олигонуклеотидов

Published: December 26, 2010
doi:

Summary

Олигонуклеотиды могут быть использованы для сайта специально заменой одного нуклеотида трансфицированных генов-мишеней в обоих<em> Anopheles gambiae</em> И<em> Anopheles stephensi</em> Клеток.

Abstract

Plasmodium паразитов, возбудителей малярии, которые передаются через укусы инфицированных комаров Anopheles в результате которых более 250 млн. новых случаев инфицирования ежегодно. Несмотря на десятилетия исследований, до сих пор нет вакцины против малярии, подчеркивая необходимость разработки стратегий роман контроля. Одним из новаторских подхода является использование генетически модифицированных комаров для эффективного контроля передачи малярии. Умышленные изменения клеточных сигнальных путей в организме комара, с помощью направленного мутагенеза, были обнаружены регулировать паразита развития 1. На основании этих исследований, мы можем начать определять потенциальные цели гена для трансформации. Целевые мутагенеза традиционно полагались на гомологичной рекомбинации между гена-мишени и большой молекулы ДНК. Тем не менее, строительство и использование таких сложных молекул ДНК для генерации стабильно трансформированные клеточные линии стоит дорого, отнимает много времени и часто неэффективны. Таким образом, стратегию, используя заблокирован нуклеиновых кислот-модифицированных олигонуклеотидов (LNA дополнений) обеспечивает полезную альтернативу для введения искусственного одиночных нуклеотидных замен в эписомной и хромосомной ДНК гена целями (см. обзор 2). МШУ-НА-опосредованной направленного мутагенеза были использованы для введения точечных мутаций в генах интереса к культуре клеток, так дрожжей и мышей 3,4. Мы покажем здесь, что LNA дополнений может быть использован для внедрения одного нуклеотида изменение трансфицированных эписомной цель, которая приводит к переключаться с синим флуоресцентным белком (ПСБ) выражение на зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в обеих Anopheles gambiae и Anopheles stephensi клетки . Это преобразование демонстрирует в первый раз, что эффективное мутагенеза генов-мишеней в комара клетки могут быть опосредованы LNA дополнений и предполагает, что этот метод может быть применим к мутагенеза хромосомных цели в пробирке и в естественных условиях.

Protocol

До начала протокола, важно определить, что комар клетки, используемые в эксперименте, были здоровы и на ~ 80% слияния, если приверженец (рис. 1). Заросший или нездоровые клетки приведет к низкой эффективности трансфекции и дают противоречивые результаты. Разминка всех средствах массовой инфо?…

Discussion

Здесь мы представляем в пробирке и метод доказательства для целевого преобразования одного нуклеотида в эписомной гена-мишени после трансфекции МШУ дополнений в A. stephensi и А. gambiae клетках. МШУ-НА-опосредованной генной конверсии требует индукции сайт-специфического ответ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Эбби Spinner в Калифорнийском Национального центра изучения приматов за помощь с проточной цитометрии. Это исследование было поддержано финансирование из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) Национального института здоровья (NIH) AI073745, AI080799 и AI078183.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Effectene transfection reagent   Qiagen 301425  
GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)   Invitrogen K4935-00  
BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO)   Gift from Dr. Concordet3    
LNA-ONs   Gift from Dr. Concordet3    
MEM, Earle’s w/ glutamine   Invitrogen 11095  
Fetal calf serum (FCS)   Invitrogen 16000  
Schneider’s Drosophila medium   Invitrogen 11730  
Non-essential amino acids   Invitrogen 11140  
10% D-glucose   Sigma G5767  
Penicillin-streptomycin antibiotic   Invitrogen 15140  
6-well culture plates   Corning 3516  

References

  1. Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
  2. Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
  3. Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
  4. Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
  5. Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
  6. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
  7. Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
  8. Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
  9. Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
  10. Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).

Play Video

Cite This Article
Pakpour, N., Cheung, K. W., Souvannaseng, L., Concordet, J., Luckhart, S. Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (46), e2355, doi:10.3791/2355 (2010).

View Video