Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays

Diego Grande; Eeson Rajendra; Bethany Mason; Alessandro Galbiati; Simon J. Boulton; Graeme C. M. Smith; Helen M. R. Robinson

doi:10.3791/66969

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Kanser Araştırmaları

Yüksek Verimli ve Kantitatif Lüminesans Tabanlı Raportör Testleri Kullanılarak DNA Çift İplikli Kırılma Onarım Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Published: June 14, 2024

doi:

10.3791/66969

Diego Grande*¹, Eeson Rajendra*¹, Bethany Mason, Alessandro Galbiati, Simon J. Boulton², Graeme C. M. Smith, Helen M. R. Robinson

¹Artios Pharma Ltd, Cambridge, ²The Francis Crick Institute, London

Özet

Bir dizi lüminesans tabanlı ekstrakromozomal raportör substrat kullanarak hücrelerde çift iplikli kopma onarım yolu yeterliliğinin değerlendirilmesi için protokoller sunuyoruz.

Abstract

DNA çift iplikçik kırılmalarının (DSB’ler) onarımı, genom stabilitesinin ve hücre canlılığının korunması için çok önemlidir. Hücrelerde DSB onarımına (DSBR) çeşitli mekanizmalar aracılık eder: homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) ve tek iplikli tavlama (SSA). Hücresel tahliller, çeşitli uyaranlara yanıt olarak bu yolların yeterliliğini ve modülasyonunu ölçmek için gereklidir.

Burada, her biri hücrelerdeki dört ana DSBR yolundan biri tarafından bir nanolusiferaz raportör geninin sulandırılmasını ölçen bir dizi ekstrakromozomal raportör testi sunuyoruz. İlgilenilen hücrelere geçici transfeksiyon üzerine, yola özgü raportör substratların onarımı, Nanolusiferaz (NanoLuc) lüminesansının tespiti ile 24 saatin altında ölçülebilir.

Bu sağlam tahliller kantitatif, hassas, titre edilebilir ve yüksek verimli bir tarama formatına uygundur. Bu özellikler, DNA onarım araştırmalarında ve ilaç keşfinde geniş uygulamalar sağlar ve şu anda mevcut olan hücresel DSBR tahlilleri araç setini tamamlar.

Introduction

DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB’ler), hücrelerin bu lezyonları onarmak için çoklu DSB onarım (DSBR) yolları geliştirmesi nedeniyle özellikle toksik bir DNA hasarı¹ sınıfını temsil eder. Dört ana DSBR mekanizması, homolog rekombinasyon (HR), homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), mikrohomoloji aracılı uç birleştirme (MMEJ) ve tek iplikli tavlamadır (SSA)^2,3. DSBR yolakları, sağlıklı doku gelişiminin ve fizyolojisinin korunmasına katkıda bulunur ve kanser gibi hastalıklara karşı koruma sağlar. Ayrıca, bu onarım mekanizmaları, hassas onkolojide küçük molekül modülatörlerinin geliştirilmesi için terapötik potansiyele sahiptir. Örneğin, MMEJ onarım yolunda çok önemli bir enzim olan DNA Polimeraz θ’yi (Polθ) hedeflemek, kanserde HR eksikliği ile sentetik ölümcüllüğü nedeniyle ilgi çekmiştir⁴.

Bu nedenle DSBR’yi anlamak geniş klinik etkilere sahiptir ve tüm ana DSBR yollarının aktivitesini ölçebilen fonksiyonel hücresel tahlillere ihtiyaç vardır⁵. Tahliller hem genetik hem de farmakolojik sorgulama için uygun olmalı ve ilgilenilen hücre modellerinde konuşlandırılabilir olmalıdır. Küçük moleküllü ilaç keşif çabalarını desteklemek için, tahlillerin son derece hassas olması, titre edilebilir olması, hızlı bir geri dönüşe sahip olması ve bileşik taraması için uygun yüksek verimli formatlara ölçeklenebilir olması gerekir.

Genel olarak, DSBR daha önce hücre genomuna⁶ kararlı bir şekilde entegre edilmiş floresan tabanlı raportör tahlil sistemleri kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, kromozomal DSBR’nin fizyolojik rekapitülasyonu belirgin bir avantaj olsa da, bu tür tahliller, raportörün entegre edildiği, emek yoğun numune hazırlama ve akış sitometrisi ile analiz kullandığı ve sınırlı verim, geri dönüş süresi, sağlamlık ve duyarlılığa sahip olduğu bir konak modelle sınırlıdır, ilaç keşif çabaları için gerekli tüm temel özellikler.

Burada, dört ana DSBR yolunun değerlendirilmesine izin veren bir dizi DSBR raportör tahlilini açıklıyoruz. Raportör tahlil substratları paketi Şekil 1’de özetlenmiştir ve yakın tarihli bir yayın^7’de daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ekstrakromozomaldirler, basit geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere girmelerine izin verirler ve belirli DSBR mekanizmaları ile etkileşime girerek yeniden yapılandırılması gereken bir nanolusiferaz raportör gen^8’in dahil edilmesi, duyarlılık, sağlamlık ve ölçeklenebilirlik sağlar. Aşağıdaki DSBR raportör substrat varyantları protokole dahil edilmiştir (Şekil 1):

Rezeksiyondan bağımsız MMEJ: Bu doğrusal substrat, rezeke edilmiş DNA uçları^9’u taklit eden tek sarmallı DNA (ssDNA) çıkıntılarına sahip bir çekirdek çift sarmallı DNA (dsDNA) bölgesinden oluşur. ssDNA bölgelerinin terminalindeki dört nükleotid mikrohomolojisi, raportör gen için başlangıç kodonunu kodlar. Bu substratın MMEJ yoluyla onarımı, raportör gen açık okuma çerçevesini (ORF) geri yükler.

Rezeksiyona bağımlı MMEJ: N-terminal raportör gen ekzonu, 8 baz çifti (bp) mikrohomoloji ile çevrili bir durdurma kodonu içeren bir segment tarafından kesilir. Sağlam raportör geni eski haline getirmek için MMEJ aracılı onarımdan önce nükleolitik uç rezeksiyonu gereklidir.

Künt NHEJ: Raportör gen, N ve C terminal bölümlerine ayrılır ve bunlardan ikincisi promotörün yukarısına yerleştirilir. DSB, EcoRV kullanılarak üretilir ve hem raportör gen bölümlerinin yeniden birleştirilmesi hem de raportör ORF’nin geri yüklenmesi için NHEJ tarafından doğrudan ligasyon (son işleme olmadan) gerektirir.

Künt olmayan NHEJ: DSB bir intron içinde bulunur ve restriksiyon enziminin seçimine bağlı olarak kohezif veya kohezif olmayan uçlara sahip olacaktır. Bu alt tabakanın NHEJ tarafından onarımı, ligasyonun son işlemden önce yapılmasını gerektirir.

Uzun şablon İK: Raportör genin N-terminal ekzonu, orijinal raportör gen dizisinin 22 bp’sinin yerini alan kısıtlama bölgelerini içeren bir DNA segmenti tarafından kesilir. Bu diziyi geri yüklemek için, HR ile onarım, C-terminal eksonunun akış aşağısına yerleştirilen 2,5 kilobaz (kb) homoloji şablonunu kullanır.

Kısa şablon İK: DSB’yi oluşturmak için gereken kısıtlama bölgesi, yerel raportör gen dizisinin bir kısmının yerini alır ve çerçeve içi bir durdurma kodonu sunar. Uzun şablon sürümü gibi, bu HR alt tabakası da raportör ORF’nin doğru onarımı ve geri yüklenmesi için aşağı akış homoloji şablonunu (360 bp) gerektirir.

SSA: Bu substrat, raportör genin N-terminal ekzonu içinde bulunan bir erken durdurma kodonu içerir. Bu durdurma kodonunun çıkarılması ve sağlam raportör gen dizisinin eski haline getirilmesi, homolojilerin hizalanmasından önce iki yönlü uzun menzilli rezeksiyonu içeren SSA ile onarım gerektirir.

DSB’nin üretilmesi için, raportör substratların bir kısmı I-SceI ile sindirilebilir (Şekil 1). Bu, ters oryantasyonlarda tandem I-SceI bölgelerine sahip rezeksiyona bağımlı MMEJ, künt olmayan NHEJ, uzun şablon HR ve SSA raportörlerinde kohezif olmayan uçlara sahip doğrusal bir substrat oluşturacaktır. Kısa şablon HR raportör substratında, tek I-SceI sitesinin sindirimi uyumlu uçlar oluşturacaktır. Künt olmayan NHEJ, rezeksiyona bağımlı MMEJ, uzun şablon HR ve SSA plazmitleri de HindIII ile sindirilebilir, bu da tamamlayıcı kohezif uçlar üretecektir.

Raportör tahlil substratlarının oluşturulması için protokoller sağlıyoruz ve tahlillerin nasıl gerçekleştirilebileceğini açıklıyoruz, küçük moleküllere titre edilebilir yanıtlar, hücresel gücün, hedef üzerindeki aktivitenin ve yol seçiciliğinin değerlendirilmesi dahil olmak üzere DSBR’yi ölçmek için nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılar sağlıyoruz.

Protocol

1. Muhabir alt tabakalarının hazırlanması ve kalite kontrolü (QC) NOT: Raportör substratları kodlayan plazmitler, standart Escherichia coli suşlarında (örneğin, DH5α ve türevleri) çoğaltılabilir ve plazmit izolasyonu ile geri kazanılabilir. Plazmid detayları (boyut ve antibiyotik direnci) Tablo 1 ve Şekil 1’de açıklanmıştır. Şekil 1: Ekstrakromozomal NanoLuc tabanlı DSBR raportör testlerinin şemaları. DSBR raportör substratlarının, her bir kaynak plazmid içindeki konumları, ana dizi özellikleri ve yola özgü onarımdan sonraki son düzen dahil olmak üzere şematik gösterimi. Rezeksiyondan bağımsız MMEJ substrat çekirdeği, XhoI/HindIII ile sindirim yoluyla kaynak plazmidden eksize edilir, daha sonra MMEJ için substratı üretmek için kapakların her iki uca bağlanması gerekir. Künt NHEJ raportör substratı, EcoRV ile kaynak plazmitten eksizyon ile oluşturulur. Rezeksiyona bağımlı MMEJ, künt olmayan NHEJ, uzun şablon HR ve SSA raportör substratları, kaynak plazmitlerin I-SceI (kohezif olmayan uçlar üreten) veya HindIII (kohezif uçlar üreten) kullanılarak doğrusallaştırılmasıyla oluşturulur. Kısa şablon HR raportör substratı, kaynak plazmitin I-SceI (yapışkan uçlar üreten) kullanılarak doğrusallaştırılmasıyla oluşturulur. Her bir raportör substratın hedef DSBR yolu ile onarımı, fonksiyonel NanoLuc’yi kodlayan sağlam bir nanolusiferaz ORF’yi yeniden oluşturur. Bu şekil Rajendra ve ark.7’den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: DSBR = çift telli kopma onarımı; NanoLuc = Nanolusiferaz; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; HR = homolog rekombinasyon; SSA = tek iplikli tavlama; ORF = açık okuma çerçevesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör substratının hazırlanması (Şekil 1 ve Şekil 2A-C)ssDNA/dsDNA kapaklarının hazırlanması (Şekil 2A)100 μM’de bir stok çözeltisi oluşturmak için Tablo 2’de listelenen dört oligonükleotidi tavlama tamponunda (20 mM Tris pH 7.5, moleküler biyoloji dereceli suda 50 mM NaCl) ayrı ayrı yeniden süspanse edin. ss/dsDNA kapaklarının tavlanması50 mL’lik bir tüpte adım 1.1.1.1’den sol kapak için uzun ve kısa oligonükleotidlerin her birini (100 μM stok çözeltisi) 0.2 μL’lik bir tüpte karıştırın. Sağ kapak oligonükleotidleri için tekrarlayın. Bir termosiklayıcı kullanarak, her oligonükleotid karışımını 99 ° C’de 5 dakika inkübe edin, ardından 1 ° C / dak’da 10 ° C’ye düşürün.NOT: Bu, tavlanmış sol ve sağ kapakları üretecektir. (QC, isteğe bağlı) Elektroforez ile oligonükleotid tavlamasının doğrulanmasıAdım 1.1.1.2’den itibaren her bir ürünün 100 ng elektroforezi, adım 1.1.1.1’den ayrı oligonükleotidler ve 80 dakika boyunca 200 V’ta akrilamid-Tris-Borat-EDTA (TBE) jeli içinde düşük moleküler ağırlıklı bir DNA merdiveni. Jeli, hem ssDNA hem de dsDNA’nın görselleştirilmesi için uygun bir floresan DNA boyası içeren TBE çalışma tamponu ile en az 10-15 dakika boyayın. Bir jel dokümantasyon sisteminde floresanı görselleştirin (Şekil 2A).NOT: 1.1.1.3.1 ila 1.1.1.3.3 arasındaki adımlar, kapakların doğru şekilde tavlandığını doğrulamak için kullanılır. Sol kapak ve sağ kapak için görünen boyutlar sırasıyla ~ 120 bp ve ~ 175 bp olmalıdır. Raportör substrat çekirdeğinin saflaştırılması (Şekil 2B)100 μg raportör çekirdek plazmidini 4 μL HindIII ve 4 μL XhoI (her enzim için 4 U/μg plazmit) ve 20 μL 10x tampon ile karıştırın. Çift damıtılmış su (ddH2O) ile toplam hacmi 200 μL’ye getirin ve plazmidi sindirmek için 37 ° C’de 2 saat ila gece boyunca inkübe edin.NOT: Daha büyük veya daha küçük miktarların sindirimi için reaksiyonu orantılı olarak ölçeklendirin. Restriksiyon enzimlerini inaktive etmek için sindirim reaksiyonunu 80 ° C’de 20 dakika inkübe edin. Adım 1.1.2.2’den itibaren reaksiyon karışımına 40 μL alkalin fosfataz (2 U/μg plazmit) ve 27 μL 10x tampon ekleyin. Plazmidi defosforile etmek için 37 ° C’de 2 saat inkübe edin.NOT: Reaksiyonu gerektiği gibi yukarı veya aşağı ölçeklendirin. Adım 1.1.2.3’teki reaksiyona 60 μL 6x yükleme boyası ekleyin. 2,5 saat boyunca veya bantlar yeterince çözülene kadar 120 V’ta bir floresan dsDNA boyası içeren% 1.5 (a / h) agaroz-Tris-Asetat-EDTA (TAE) jelinde yüksek moleküler ağırlıklı bir DNA merdiveninin yanında elektroforez. Bir jel dokümantasyon sisteminde floresanı görselleştirin (Şekil 2B). Raportör çekirdek parçasını (~ 1.5 kb) temiz bir neşter kullanarak jelden çıkarın ve vektör omurgası (~ 2.5 kb) ile kontamine olmamasına dikkat edin. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak raportör çekirdek parçasını çıkarın. Spektrofotometri ile DNA konsantrasyonunu ve kalitesini (A260/280) ölçün. Raportör substrat çekirdeğinin ssDNA/dsDNA kapakları ile bağlanması ve son raportör substratının saflaştırılması (Şekil 2C)Adım 1.1.2.7’den 30 μg raportör çekirdek fragmanını, adım 1.1.2’den her tavlanmış sol ve sağ kapağın 3.85 μL’si ile karıştırın (yaklaşık 6: 1 molar kapak: çekirdek DNA oranı), 30 μL 10x ligaz tamponu ve 1.5 μL T4 DNA ligaz (20 U / μg DNA). Reaksiyonun toplam hacmini ddH2O ile 300 μL’ye getirin ve kapakları raportör çekirdek parçasına bağlamak için gece boyunca 16 ° C’de inkübe edin.NOT: Reaksiyonu gerektiği gibi yukarı veya aşağı ölçeklendirin. (QC, isteğe bağlı) Raportör substrat çekirdeği ve en az 1.5 saat boyunca 120 V’ta bir floresan dsDNA boyası içeren% 0.7 (a / h) agaroz-TAE jeli içinde yüksek moleküler ağırlıklı bir DNA merdiveni ile birlikte adım 1.1.3.1’den elde edilen ürünün 200 ng’si elektroforez. Bağlanmış ürüne karşılık gelen bandın, bağlanmamış raportör alt tabaka çekirdeğinden biraz daha yavaş bir hızda hareket ettiğini doğrulayın (Şekil 2C).NOT: Bu QC adımı, raportör çekirdek parçasına kapakların bağlanmasının doğru bir şekilde gerçekleştiğini doğrulamak içindir. Adım 1.3.1’de DNA’yı sindirim reaksiyonundan saflaştırın. Tercih edilen yöntemi (örneğin, boncuk tabanlı veya sütun tabanlı bir yöntem) kullanarak, üreticinin talimatlarını izleyerek.NOT: Saflaştırma adımı 1.1.3.3, bağlanmamış kapakların varlığını önemli ölçüde azaltır. Spektrofotometri ile DNA konsantrasyonunu ve kalitesini (A260/280) ölçün. Künt NHEJ raportör substratının hazırlanması (Şekil 1 ve Şekil 2D,E)100 μg raportör çekirdek plazmidini 5 μL EcoRV (5 U/μg plazmit) ve 20 μL 10x tampon ile karıştırın. ddH2O ile toplam hacmi 200 μL’ye getirin ve plazmidi sindirmek için 37 ° C’de 2 saat ila gece boyunca inkübe edin.NOT: Daha büyük veya daha küçük miktarların sindirimi için reaksiyonu orantılı olarak ölçeklendirin. Restriksiyon enzimini ısıtarak inaktive etmek için sindirim reaksiyonunu 65 ° C’de 20 dakika inkübe edin. Adım 1.2.2’den itibaren reaksiyona 50 μL 6x yükleme boyası ekleyin. 2 saat boyunca veya bantlar yeterince çözülene kadar 120 V’ta bir floresan dsDNA boyası içeren% 1.5 (a / h) agaroz-TAE jelinde yüksek moleküler ağırlıklı bir DNA merdiveninin yanında elektroforez. Bir jel dokümantasyon sisteminde floresanı görselleştirin (Şekil 2D). Raportör substratını (~ 1.7 kb) temiz bir neşter kullanarak jelden çıkarın ve vektör omurgası (~ 2.6 kb) ile kirlenmemeye dikkat edin. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak raportör çekirdek parçasını çıkarın (Şekil 2E). Spektrofotometri ile DNA konsantrasyonunu ve kalitesini (A260/280) ölçün. I-SceI tabanlı raportör alt tabakalarının hazırlanması (Şekil 1)NOT: Bu substratlar arasında rezeksiyona bağımlı MMEJ (Şekil 2F), künt olmayan NHEJ (Şekil 2G), uzun şablon HR (Şekil 2H), kısa şablon HR (Şekil 2I) ve SSA (Şekil 2J) bulunur.100 μg raportör çekirdek plazmidini 50 μL I-SceI (5 U/μg plazmit) ve 60 μL 10x tampon ile karıştırın. ddH2O ile toplam hacmi 600 μL’ye getirin ve plazmidi sindirmek için 37 ° C’de 2 saat ila gece boyunca inkübe edin.NOT: Daha büyük veya daha küçük miktarların sindirimi için reaksiyonu orantılı olarak ölçeklendirin. Künt olmayan NHEJ, rezeksiyona bağımlı MMEJ, uzun şablon HR ve SSA plazmitleri de HindIII ile sindirilebilir, bu da tamamlayıcı kohezif uçlar oluşturacaktır. I-SceI’i ısıtmak için sindirim reaksiyonunu 65 ° C’de 20 dakika inkübe edin. Üreticinin talimatlarını izleyerek, tercih edilen yöntemi (örneğin, boncuk bazlı veya sütun bazlı bir yöntem) kullanarak adım 1.3.2’deki inaktive edilmiş sindirim reaksiyonundan DNA’yı saflaştırın. DNA konsantrasyonunu ve saflığını A260/280) spektrofotometri ile ölçün. Raportör alt tabakalarının kalite kontrolü200 saat boyunca veya bantlar yeterince çözülene kadar 120 V’ta bir floresan dsDNA boyası içeren% 0.7 (a / h) agaroz-TAE jeli içinde yüksek moleküler ağırlıklı bir DNA merdiveni ile birlikte raportör substratının 200 ng’sini elektroforez. Orijinal kesilmemiş raportör plazmidini kontrol olarak yükleyin. Her raportör alt tabakası için doğru boyutta tanımlanmış bantların gözlemlendiğini doğrulayın (Tablo 1 ve Şekil 2F-J’ye bakın). Şekil 2: DSBR raportör substrat üretiminin jel elektroforetik analizleri. (A-C) Rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör substratının oluşturulması için gerekli olan ara ürünlerin ve nihai yapının jel elektroforetik analizinden temsili görüntüler. (A) ve (C) panellerindeki bitişik görüntüler aynı jellerdendir; Alakasız şeritler atlandı. (D,E) Kaynak plazmid, EcoRV ile sindirilmiş ürünler ve künt NHEJ raportör substratının oluşturulması için gerekli jel ekstrakte edilmiş nihai yapı için jel elektroforetik analizinden temsili görüntüler. (F-J) I-SceI-sindirilmiş raportör substratları için kaynak plazmitlerin ve doğrusallaştırılmış DSBR yapılarının jel elektroforetik analizinden temsili görüntüler: rezeksiyona bağlı MMEJ, künt olmayan NHEJ, uzun şablon HR, kısa şablon HR, SSA. Kısaltmalar: DSBR = çift telli kopma onarımı; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; HR = homolog rekombinasyon; SSA = tek iplikli tavlama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 2. DSBR raportör substratlarının geçici transfeksiyonu NOT: Tahlillerin deneysel iş akışına ve bazı potansiyel permütasyonlara genel bir bakış Şekil 3’te özetlenmiştir. Aşağıdaki protokol, HEK-293 hücrelerinin kullanıldığı, bunların raportör substrat ile ters transfekte edildiği bir deneyi açıklamaktadır. Aşağıdaki sayılar, plaka başına kullanılacak kuyu sayısına göre yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. 96 oyuklu bir plakada gerçekleştirilen bir tahlil için aşağıdaki adımlar hesaplanır; Dikkat edilecek diğer noktalar için Tartışma bölümüne bakın. Şekil 3: DSBR raportör tahlilleri için deneysel iş akışı. İlgilenilen hücreler, doğrusallaştırılmış DSBR substratı (belirli bir DNA onarım olayı ile onarılması gereken bir NanoLuc ORF’yi kodlar) ve bir Firefly plazmidi (transfeksiyon kontrolü) ile transfekte edilir. Daha sonra, transfeksiyondan 6-24 saat sonra, Ateşböceği lüminesansı ve NanoLuc lüminesansı, Nano-Glo Çift Lusiferaz reaktiflerinin eklenmesini takiben sırayla okunabilir. Genetik modülasyonun (nakavt, nakavt veya aşırı ekspresyon) veya farmakolojik tedavinin hücrelerde DSBR yolu yeterliliğini nasıl etkilediğini test etmek için çekirdek adımlara (açık mavi kutular içinde gösterilmiştir) örnek permütasyonlar kullanılabilir. Kısaltmalar: DSBR = çift telli kopma onarımı; NanoLuc = Nanolusiferaz; WT = vahşi tip; KO = nakavt. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. (İsteğe bağlı) Bileşiklerin raportör tahlili üzerindeki etkisini değerlendiriyorsanız, araçta çözünen bileşikleri (örneğin, dimetil sülfoksit [DMSO]) önceden tanımlanmış bir deney düzenine göre 96 oyuklu bir plakanın kuyularına dağıtın. Tüm kuyularda araç konsantrasyonunu normalleştirin.NOT: Teknik kopyalar önerilir. Kontrol kuyularını dahil edin (örneğin, yalnızca araç). 1.5 mL’lik bir tüpte, 500 μL transfeksiyon tamponunda 1.1, 1.2 veya 1.3 adımlarında üretilen Firefly kontrol plazmidini (kontrol lusiferaz) ve NanoLuc DSBR raportör substratını (raportör lusiferaz) seyreltin. 1 × 106 hücre başına 0.66 μg kontrol lusiferaz plazmidi kullanın. Kullanılacak NanoLuc DSBR muhabir substratının miktarları için Tablo 3’e bakın.NOT: Raportör lusiferazı yapısal olarak ifade eden pozitif bir kontrol plazmiti, alet kurulumunu ve transfeksiyon koşullarını doğrulamak veya raportör lusiferazın kendisi üzerindeki spesifik olmayan etkileri kontrol etmek için kullanılabilir. Başlangıç noktası olarak, ×1 ila 106 hücre başına 0.1 μg raportör lusiferaz plazmidi ve 0.66 μg kontrol lusiferaz plazmidi öneriyoruz. Lipid bazlı transfeksiyon reaktifini, üreticinin tavsiye ettiği oranda 2.2. adımdan seyreltilmiş DNA’ya ekleyin (örneğin, Malzeme Tablosunda açıklanan reaktif için 1: 2, μg DNA: μL reaktifi), kısaca girdaplayarak iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreleri tripsinizasyon ile hasat edin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren taze ortamda yeniden süspanse edin ve sayın. 3 × 106 hücreyi 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve 8.5 mL ortamda yeniden süspanse edin. Adım 2.3’teki DNA transfeksiyon karışımını hücre süspansiyonuna ekleyin ve ters çevirerek birkaç kez karıştırın. Plaka 80 μL hücre süspansiyonu (kuyucuk başına yaklaşık 2.7 × 104 hücre).NOT: Hücreler ve DNA transfeksiyon karışımı içeren süspansiyon, manuel olarak pipetlenerek veya daha yüksek verimli deneyler için otomatik bir sıvı işleyici kullanılarak plakaya dağıtılabilir. 37 °C /% 5 CO2’de 24 saat inkübe edin. 3. Lüminesansın tespiti Reaktiflerin hazırlanmasıHer iki lusiferaz (sırasıyla Furimazin ve 5′-Florolusiferin) için substratları sağlayan raportör (NanoLuc) ve kontrol (Firefly) lusiferaz reaktiflerinin hazırlanması ve eklenmesi için üreticinin talimatlarına uyun: Kontrol lusiferaz reaktifini hazırlayın. Üreticinin talimatlarına göre sulandırın ve lusiferaz substratı tamamen çözülene kadar ters çevirerek karıştırın. Üreticinin talimatlarına göre taze muhabir lusiferaz reaktifi hazırlayın. 80 μL/kuyucuk eklemek için gereken reaktif miktarını hesaplayın ve substratı 1:100 oranında uygun bir tahlil tamponu hacmine ekleyin (lusiferaz substratı: tampon). 96 oyuklu bir plaka için, 88 μL lusiferaz substratını 8.800 μL tampona seyreltin ve ters çevirerek karıştırın.NOT: Bu miktarlar yaklaşık ‘luk bir fazlalık içerir. Sulandırıldıktan sonra, kontrol lusiferaz reaktifi, ileride kullanılmak üzere üreticinin talimatlarına göre saklanabilir. Raportör lusiferaz reaktifi her kullanım için taze olarak hazırlanmalıdır. Kontrol ve raportör lusiferazlardan (96 kuyulu plaka) lüminesansın seri tespitiPlaka ve lusiferaz reaktiflerinin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Kuyucuk başına 80 μL kontrol lusiferaz reaktifi ekleyin. Plakayı 450 rpm’de bir orbital çalkalayıcıda 3 dakika çalkalayın. Kontrol lusiferaz lüminesans sinyalini bir lüminesans plakası okuyucu ile ölçün.NOT: 580 nm’de (80 nm bant geçiren filtre) emisyonu veya kuyu başına toplam lüminesansı okuyun. Bu lüminesans, transfeksiyon verimliliğinin ve hücre yoğunluğunun bir ölçüsü olarak kullanılır ve ayrıca test tedavilerinin neden olduğu hücresel toksisite hakkında bilgi verebilir. Kuyucuk başına 80 μL raportör lusiferaz reaktifi ekleyin.NOT: Bu reaktif, kontrol lusiferazı inhibe edecektir; Aynı zamanda muhabir Luciferase için substratı da içerir. Plakayı 450 rpm’de bir orbital çalkalayıcıda 3 dakika çalkalayın. Plakayı oda sıcaklığında 7 dakika dinlenmeye bırakın. Muhabir lusiferaz lüminesans sinyalini bir lüminesans plakası okuyucusu ile ölçün.NOT: 470 nm’de (80 nm bant geçiren filtre) emisyonu veya alternatif olarak kuyu başına toplam lüminesansı okuyun. Bu lüminesans, ilgilenilen DSBR yolu tarafından onarılan raportör substrat miktarı hakkında bilgi verir. Aşağı akış analizi için lüminesans okumalarını dışa aktarın. 4. Veri analizi Tahlil sinyalini hesaplamak için raportör lusiferaz (NanoLuc) lüminesans sinyalini aynı kuyudan çıkan kontrol lusiferaz (Ateşböceği) lüminesans sinyaline bölün. Bu hesaplamayı denklem (1)’de gösterildiği gibi tüm kuyucuklara uygulayın.(1) Kontrol kuyuları için tahlil sinyallerinin ortalamasını hesaplayın (örn. yalnızca araç). Kuyu başına Onarımı (%) hesaplamak için denklem (2) kullanarak test kuyuları için tahlil sinyallerini kontrol kuyusu ortalamasına normalleştirin. (2) (İsteğe bağlı, eğri uydurma) Birden fazla bileşik dozu test ediyorsanız, hesaplanan Onarımı (%) bileşik konsantrasyonuna göre çizin ve doğrusal olmayan bir regresyon modeli kullanarak bir doz-yanıt eğrisine uyun. Sonraki EC50 enterpolasyonu için bu eğriyi kullanın.

Representative Results

Raportör tahlillerinin her birinin onarımı, aynı prosedür kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir. Bir substratın hücrelerdeki akraba onarım yolu ile doğru onarımı, NanoLuc’u kodlayan sağlam, işlevsel bir ORF’yi yeniden oluşturacaktır. Bu lüminesans sinyali bir plaka okuyucu kullanılarak tespit edilebilir. Firefly lusiferazı kodlayan sağlam bir plazmit ile birlikte transfeksiyon, bir transfeksiyon kontrolü görevi görür. Bu kontrol iki amaca hizmet eder. İlk olarak, DSBR’nin genetik veya farmakolojik yollarla modülasyonu ile bozulmaması gerektiğinden, NanoLuc sinyalini normalleştirmek için bir standart sağlar. İkincisi, hücre döngüsü modülasyonu, transkripsiyon/translasyon üzerindeki etkiler veya genel toksisite gibi lusiferaz sinyalini etkileyen hedef dışı hücresel bozulmaların bir göstergesini sağlayabilir. NanoLuc’un Firefly’a oranı, onarımın vekil bir okuması olarak hizmet eder. Lüminesans değerleri, aynı kuyu içinden iki lusiferaz sinyalinin normalleştirilmesiyle dışa aktarılabilir ve analiz edilebilir. Genetik bozulma çalışmaları söz konusu olduğunda (örneğin, vahşi tip ve KO veya hedeflenmeyen ve hedef siRNA’nın karşılaştırılması), onarım genellikle ebeveyn numunesine (vahşi tip hücreler veya hedeflemeyen kontrol siRNA ile tedavi edilen hücreler) normalize edilir. Farmakolojik modülasyon durumunda, bileşikle muamele edilmiş bir numuneden alınan değerler, araç muamelesi tarafından üretilen değere normalize edilir. Açıklanan muhabir paketinin tam doğrulaması yakın zamanda yayınlandı7. DSBR’nin genetik ve farmakolojik modülasyonunun karakterizasyonunu örnekleyen veriler Şekil 4’te gösterilmiştir (7’den uyarlanmıştır). Polθ, MMEJ’nin anahtar aracısıdır ve bu enzimin kaybının veya inhibisyonunun hücresel MMEJ 3,10’u spesifik olarak ablate ettiği tahmin edilmektedir. Polθ’yu kodlayan gen olan POLQ’nun 11 nakavt edildiği bir hücre hattı kullanılarak, rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör testi, MMEJ’nin gerçekten neredeyse tamamen bastırıldığını göstermektedir. Bileşen NanoLuc ve Firefly lüminesans sinyallerinin değerlendirilmesi, gözlemlenen onarım kusurunun, Firefly sinyali (kontrol) bozulmazken NanoLuc sinyalindeki (raportör substrat tarafından kodlanan) bir azalma tarafından yönlendirildiğini göstermektedir (Şekil 4A-C). Buna karşılık, künt uçlu NHEJ raportörü kullanılarak NHEJ yeterliliğinin değerlendirilmesi, POLQ nakavtının raportör substratının onarımını engellemediğini göstermektedir (Şekil 4D-F). Birlikte, bu genetik veriler MMEJ aracılı onarımda Polθ’nin spesifik rolünü desteklemektedir. Bu gözlemler, Polθ’nun polimeraz alanının yakın zamanda bildirilen oldukça güçlü ve spesifik bir inhibitörü olan ART55812,13 ile farmakolojik olarak tamamen özetlenmiştir (Şekil 4G), burada MMEJ’nin titre edilebilir inhibisyonu gözlenir, bu da Ateşböceği sinyalinde değil NanoLuc’ta belirli bir azalmadan kaynaklanır (Şekil 4H). Ayrıca, genetik verilerle uyumlu olarak, NHEJ üzerinde herhangi bir etkisi yoktur (Şekil 4I, J). Bu veriler birlikte, bu raportörlerin DSBR yolaklarının genetik modülasyonunu karakterize etmek ve küçük moleküllerin hücresel gücünü ve hedef/yol özgüllüğünü göstermek için nasıl kullanılabileceğini vurgulamaktadır. Şekil 4: Polθ’nun genetik nakavt ve farmakolojik inhibisyonunun MMEJ ve NHEJ raportör sinyalleri üzerindeki etkileri. eHAP1, WT ve POLQ(-) hücreleri, Firefly kontrol plazmidi ve (A-C) rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportörü veya (D-F) künt uçlu NHEJ raportörü ile transfekte edildi. MMEJ veya NHEJ onarımının yüzdesi, transfeksiyondan 24 saat sonra DMSO ile muamele edilen kontrole normalize edilmiş, Ateşböceği lüminesansı üzerindeki NanoLuc lüminesansının oranıdır. Veriler, her biri ortalama 8 teknik kopya olan üç biyolojik kopyanın ortalama ± SEM’ini temsil eder. HEK-293 hücreleri, bir Ateşböceği kontrol plazmidi ve (G, H) rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportörü veya (I, J) künt uçlu NHEJ raportörü ile transfekte edildi ve Polθ polimeraz inhibitörü ART558 ile tedavi edildi. Onarım yüzdesi, transfeksiyondan 24 saat sonra, DMSO ile muamele edilen kontrole normalize edilmiş, Ateşböceği lüminesansı üzerindeki NanoLuc lüminesansının oranıdır. (G) ve (I)’deki bireysel lüminesans sinyallerinin yüzde inhibisyonu, DMSO ile muamele edilen kontrole göre hesaplandı ve sırasıyla (H) ve (J)’de gösterildi. Veriler, her biri ortalama 4 teknik kopya olan 2 biyolojik kopyanın ortalama ± SEM’ini temsil eder. Bu şekil Rajendra ve ark.7’den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: NanoLuc = Nanolusiferaz; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; WT = vahşi tür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: RAD51 inhibitörü CAM833 tarafından HR raportör sinyalinin inhibisyonu. (A) HEK-293 hücreleri, bir Firefly lusiferaz kontrol plazmidi olan uzun şablon HR raportör substratı ile transfekte edildi ve RAD51 inhibitörü CAM83314 ile muamele edildi. NanoLuc ve Ateşböceği lüminesansı, transfeksiyondan 16 saat sonra okundu. HR onarımının yüzdesi, DMSO ile muamele edilen kontrole normalize edilmiş, NanoLuc lüminesansının Firefly lüminesansı üzerindeki oranıdır. Kesikli çizgiler, EC 50 eğrisinde HR inhibisyonu yüzdesini veCAM833 konsantrasyonunu vurgular. Veriler, her biri ortalama 4 teknik kopya olan 2 biyolojik kopyanın ortalama ± SEM’ini temsil eder. (B) (A)’daki bireysel lüminesans sinyallerinin yüzde inhibisyonu, DMSO ile muamele edilen kontrole göre hesaplanmıştır. Kesikli çizgiler, 3,33 μM CAM833’te (EC50) NanoLuc ve Firefly inhibisyon yüzdesini vurgular. CAM833 konsantrasyonlarında 10 μM’≥ Firefly sinyalindeki azalma, yüksek dozlarda bileşik toksisitenin göstergesidir; bununla birlikte, Firefly sinyalinin etkilenmediği konsantrasyonlarda NanoLuc sinyalinde azalma gözlenir, bu da CAM833’ün hedef HR inhibisyonunu indüklediğini düşündürür. Bu şekil Rajendra ve ark.7’den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: NanoLuc = Nanolusiferaz; HR = homolog rekombinasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Muhabir alt tabakası Kaynak plazmit(kb cinsinden boyut, direnç) DSB üretimi Son raporlayıcı alt tabakasının beklenen boyutu (kb) Rezeksiyondan bağımsız MMEJ 4.0, Kan Kapakların ligasyonu ile 3′ kuyrukları rezeke edildi 1.6 Rezeksiyona bağımlı MMEJ 6.5, Kan I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu) 6.5 Künt NHEJ 4.3, Kan EcoRV ile plazmidden eksizyon üzerine künt uçlar 1.7 Künt olmayan NHEJ 6.7, Kan I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu) 6.5 Uzun şablon HR 9.2, Kan I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu) 9.2 Kısa şablon İK 9.3, Amplifikatör I-SceI (birleştirici) 9.3 SSA 9.5, Kan I-SceI (uyumlu olmayan), HindIII (uyumlu) 9.5 Tablo 1: Raportör substrat plazmitleri. Kısaltmalar: DSB = çift iplikçik kopması; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; HR = homolog rekombinasyon; SSA = tek iplikli tavlama; Kan = kanamisin; Amp = ampisilin. Sıra (5′-3′) Tedarikçi Arıtma Fonksiyon 5′[Fos]TCGAGGACTTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCCCCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT Sigma SAYFA Sol kapak, uzun oligonükleotid 5′[Fos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC Sigma SAYFA Sol kapak, kısa oligonükleotid 5′[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTATÇACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGGGCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG Sigma SAYFA Sağ kapak, uzun oligonükleotid 5′[Fos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCAATAA Sigma SAYFA Sağ kapak, kısa oligonükleotid Tablo 2: Rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör substratının oluşturulması için kapaklar için oligonükleotidler. Kısaltmalar: ssDNA = tek sarmallı DNA; dsDNA = çift sarmallı DNA; MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; SAYFA = poliakrilamid jel elektroforezi. Mikrohomolojilerin altı çizilmiştir. Muhabir tahlili NanoLuc raportör substrat DNA’sı (μg DNA/1×106 hücreli) Ateşböceği kontrolü lusiferaz plazmidi (μg DNA/1×106 hücre) Rezeksiyondan bağımsız MMEJ 0.5 0.66 Rezeksiyona bağımlı MMEJ 1 0.66 Künt NHEJ 0.5 0.66 Künt olmayan NHEJ 0.5 0.66 Uzun şablon HR 1 0.66 Kısa şablon İK 2 0.66 SSA 1 0.66 Tablo 3: NanoLuc raportör substratlarının ve Firefly kontrol lusiferaz plazmidinin (HEK-293, 96 oyuklu plaka formatı) geçici transfeksiyonu için DNA miktarları. Kısaltmalar: MMEJ = mikrohomoloji aracılı uç birleştirme; NHEJ = homolog olmayan uç birleştirme; HR = homolog rekombinasyon; SSA = tek iplikli tavlama.

Discussion

Burada, dört ana DSBR yolunun (HR, NHEJ, MMEJ ve SSA) hücresel yeterliliğini ölçmek için bir dizi ekstrakromozomal lüminesans tabanlı raportörün oluşturulması ve uygulanması için protokolleri ^{tanımladık7}. Raportör substratlar, geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere sokulabilir ve aynı kökenli hücresel DSBR yolakları ile etkileşime girdikten sonra yeniden oluşturulan hassas ve sağlam bir plaka bazlı NanoLuc lüminesans okuması kullanılarak DSBR aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

Raportör substrat üretiminin çeşitli aşamaları, substratların hücrelere transfeksiyonu ve veri yorumlama, bu tahlillerin başarılı bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Raportör substratları oluşturmak için standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılsa da, sürecin jel elektroforezi ile görselleştirilmesi, transfeksiyondan önce substratların en yüksek kalitesini ve saflığını sağlar. Bu tahliller geçici transfeksiyona bağlı olduğundan, bu yöntemler için ortak hususlar geçerlidir. Bunlar, tohumlama yoğunluğunun, transfeksiyon koşullarının (reaktifler ve DNA miktarları dahil) optimize edilmesini ve ileri ve geri transfeksiyon formatlarında uygunluğun değerlendirilmesini içerir. Bu raportör tahlilleri, bir dizi elektroporasyon ve lipofeksiyon protokolü ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiştir ve bu tahliller yapılmadan önce seçenekler tam olarak araştırılmalıdır. Ayrıca, NanoLuc sinyalinin (raportör substratı) Firefly sinyaline (kontrol) normalleştirilmesiyle türetilen kompozit onarım sinyali yerine, bileşen NanoLuc ve Firefly sinyallerinin incelenmesine de özen gösterilmelidir. Artefaktlar, Firefly sinyalindeki değişiklikler tarafından yönlendirilen orandan kaynaklanabilir. Örneğin, oldukça spesifik bir bileşik kullanılarak doz-yanıt modunda inhibisyonu değerlendirmek, NanoLuc sinyalini, kararlı kalması gereken Firefly sinyalini bozmadan titre edilebilir bir şekilde bastırmalıdır (Şekil 4G, H). Bununla birlikte, Firefly sinyallerinin bozulduğu durumlarda, Firefly sinyalinin etkilenmediği bir doz penceresi belirlenerek onarım üzerindeki yararlı etkiler yine de belirlenebilir (Şekil 5).

En sık kullanılan DSBR raportör tahlilleri ile karşılaştırıldığında, bu ekstrakromozomal lüminesans tabanlı raportör tahlillerinin bazı belirgin avantajları vardır. DSBR yolları yüksek oranda korunduğundan, hücresel makineler hücre modelleri arasında farklılık gösterse bile, tahliller yine de DSBR yeterliliği ve yol seçimi hakkında rapor verebilir. Bu, DSBR’nin değerlendirmesini, optimum geçici transfeksiyon koşulları önceden oluşturulduğu sürece, kullanıcının ilgilendiği herhangi bir modele açar.

Raportör gen olarak Nanolusiferaz’ın kullanılması, DSBR raportör tahlillerinde geleneksel olarak kullanılan floresan seçeneklerine göre de avantajlar sunar. NanoLuc hızlı olgunlaşır ve lüminesans, bir plaka okuyucu⁸ kullanılarak yüksek hassasiyetle tespit edilir. Substrat onarımının hızıyla birleştiğinde (raportör substratlar, onarıma hazır DSB uçlarına sahip hücrelere transfekte edildiğinden), bu DSBR raportör testi formatı, endüstriyel bir ilaç keşif kademesinin bir parçası olarak küçük molekülleri taramak için gereken hızlı geri dönüş ve kantitatif sağlamlık için idealdir. Gerçekten de, yakın zamanda, Polθ polimeraz alanı^13’ün küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanması için kullanılan keşif kaskadında rezeksiyondan bağımsız MMEJ raportör testinin uygulanmasını tanımladık.

DSBR’nin genetik ve farmakolojik bozulmaları hakkında spesifik soruları ele almak için raportör testlerinin uygulanmasında da esneklik vardır (Şekil 3). Örneğin, raportör substratların transfeksiyonundan önce, hücreler 48-72 saat boyunca ilgilenilen bir gene karşı siRNA ile transfekte edilebilir. Alternatif olarak, gen aşırı ekspresyonunun DSBR yolakları üzerindeki etkileri, raportör substratların transfeksiyonundan 24-48 saat önce plazmit transfeksiyonu gerçekleştirilerek test edilebilir. Farmakolojik çalışmalar için, mevcut protokol zaten küçük moleküllerin kullanımının standart iş akışına nasıl dahil edilebileceğini açıklamaktadır, ancak alternatif formatlar, ön inkübasyonlar veya yıkamalar gibi bileşik tedavi rejimlerinde değişiklikler içerebilir.

Geçici transfeksiyonun ölçeklenebilirliği, raportör substratlarının toplu transfeksiyonunun taramadan önce gerçekleştirildiği büyük ölçekli tarama yaklaşımlarını da destekleyebilir. Ayrıca, transfeksiyondan okumaya kadar testin süresi de değişebilir. Standart süreler 16-24 saat olabilse de, bazı testler 6 saat gibi kısa bir sürede okunabilir⁷. Hücre canlılığını tehlikeye atabilecek küçük moleküllerden veya siRNA’dan kaynaklanan toksisite ile ilgili endişeler de test süresinin belirlenmesinde dikkate alınmalıdır.

Özetle, bu çalışmada özetlenen ve yakın tarihli bir yayında⁷ tam olarak açıklanan tahliller, hücresel DSBR yeterliliğinin hızlı ve sağlam bir değerlendirmesini sağlar. Oldukça hassas ve titre edilebilirler, bu da onları hem genetik hem de farmakolojik çalışmalara uygun hale getirir. En önemlisi, raportör substratlar geçici transfeksiyon yoluyla hücrelere sokulabildiğinden, kromozomal DSBR raportörlerinde olduğu gibi kararlı entegrasyon ile belirli hücre hatlarıyla sınırlı kalmak yerine, ilgilenilen herhangi bir transfekte edilebilir hücre modelinde kullanılma potansiyeline sahiptirler. Bununla birlikte, bu raportör ekstrakromozomal tahlillerin belirgin bir sınırlaması, genoma entegrasyon eksikliğinin, DNA onarımının fizyolojik, kromatinize bağlamını ve bununla ilişkili düzenleyici ipuçlarını ve orkestrasyonunu tam olarak özetleyemeyebilmesidir¹⁵. Bu amaçla, ekstrakromozomal raportör tahlilleri, mevcut DSBR değerlendirme yöntemlerini tamamlayıcı niteliktedir ve hem temel araştırma hem de ilaç keşfi için uygun kaynak araç setini genişletir.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tüm çalışmalar Artios Pharma Ltd. tarafından finanse edildi. Şekil 1 ve Şekil 3 Biorender.com ile oluşturuldu.

Materials

10x TBE buffer	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-acrylamide gel	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE buffer	Fisher Scientific	BP13321
6x Gel Loading Dye, Purple	NEB	B7024S
96-well white plate (with transparent bottom and lid)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	For bead-based purification of DNA
Antarctic phosphatase and 10X buffer	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	Plate reader
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher	AMQAX1000	Cell counter
Custom oligonucleotides	Sigma-Aldrich	Custom order	For resection-independent MMEJ substrate. See Table 2.
D300e	Tecan	30100152	DMSO-based compound dispenser
D300e D4+ cassette	Tecan	30097371	High volume cassette for D300e compound dispenser
D300e T8+ cassette	Tecan	30097370	Low volume cassette for D300e compound dispenser
Dimethyl sulfoxide, cell culture grade	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Vehicle for compounds, used in Figure 4 and Figure 5
DSBR reporter source plasmids	Artios		Available to the academic community upon request
EcoRV-HF and 10x CutSmart buffer	NEB	R3195M
Ethanol absolute	VWR	20821.365
Foetal Bovine Serum	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler Ultra Low Range DNA Ladder	Thermo Fisher	SM1211	Low molecular weight DNA ladder
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573	Example cell line used in protocol
HindIII-HF and 10x CutSmart buffer	NEB	R3104M
HyClone Molecular Biology grade water	Fisher Scientific	10275262
I-SceI and 10x Tango Buffer	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME reagent and buffer	PolyPlus	114-15	Lipid-based transfection reagent
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	Centrifuge for 15 or 50 mL tubes
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	Culture medium for HEK-293 cells
Microplate shaker	Fisherbrand	15504070	Microplate orbital shaker
MicroStar 17R	VWR	521-1647	Centrifuge for 1.5 or 2 mL tubes
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	Cell or water-based reagent dispenser
MultiDrop Standard Cassette	Thermo Fisher	24072670	Cassette for MultiDrop reagent dispenser
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate	Promega	N1630 or N1650	Reporter luciferase (NanoLuc) reagent to quench Firefly luminescence and detect NanoLuc luminescence. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
ONE-Glo EX Luciferase Assay Buffer and Substrate	Promega	N1630 or N1650	Control luciferase (Firefly) assay reagent to detect Firefly. Part of the Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System kit
PBS (without calcium or magnesium)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Firefly plasmid (or similar)	Promega	E1310 (or equivalent)	Firefly control plasmid
pNL1.1 NanoLuc plasmid (or similar)	Promega	N1091 (or equivalent)	NanoLuc control plasmid, for adjustment of equipment settings/optimisation experiments
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder	NEB	N0552S	High molecular weight DNA ladder
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5	Thermo Fisher	AM9740	For pH adjustment during gel extraction with QIAquick Gel Extraction Kit
SYBR Gold (10,000x)	Invitrogen	S11494	For visualisation of ssDNA and dsDNA
SYBR Safe (10,000x)	Invitrogen	S33102	For visualisation of dsDNA only
T4 DNA Ligase and 10x Ligase buffer	NEB	M0202L
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	For measurement of viability during cell counting
Trypsin-EDTA solution; 0.25% Trypsin and 0.53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI and 10x CutSmart buffer	NEB	R0146M

Referanslar

Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
Ramsden, D. A., Carvajal-Garcia, J., Gupta, G. P. Mechanism, cellular functions and cancer roles of polymerase-theta-mediated DNA end joining. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 125-140 (2022).
Ceccaldi, R., et al. Homologous-recombination-deficient tumours are dependent on Polθ-mediated repair. Nature. 518 (7538), 258-262 (2015).
Bvan de Kooij, B., van Attikum, H. Genomic reporter constructs to monitor pathway-specific repair of DNA double-strand breaks. Front Genet. 12, 809832 (2021).
Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920 (9), 379-391 (2012).
Rajendra, E., et al. Quantitative, titratable and high-throughput reporter assays to measure DNA double strand break repair activity in cells. Nucleic Acids Res. 52 (4), 1736-1752 (2024).
Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
Wyatt, D. W., et al. Essential roles for polymerase θ-mediated end joining in the repair of chromosome breaks. Mol Cell. 63 (4), 662-673 (2016).
Wood, R. D., Doublié, S. Genome protection by DNA polymerase θ. Annu Rev Genet. 56, 207-228 (2022).
Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Mol Cell. 82 (24), 4664-4680.e9 (2022).
Zatreanu, D., et al. Polθ inhibitors elicit BRCA-gene synthetic lethality and target PARP inhibitor resistance. Nat Commun. 12 (1), 3636 (2021).
Stockley, M. L., et al. Discovery, characterization, and structure-based optimization of small-molecule in vitro and in vivo probes for human DNA polymerase theta. J Med Chem. 65 (20), 13879-13891 (2022).
Scott, D. E., et al. A small-molecule inhibitor of the BRCA2-RAD51 interaction modulates RAD51 assembly and potentiates DNA damage-induced cell death. Cell Chem Biol. 28 (6), 835-847.e5 (2021).
Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).

Etiketler

Kanser Araştırmaları Non-homologous End Joining Microhomology-mediated End Joining Single Strand Annealing Nanoluciferase Reporter Assay High-throughput Screening DNA Repair Research Drug Discovery

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

.

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Grande, D., Rajendra, E., Mason, B., Galbiati, A., Boulton, S. J., Smith, G. C. M., Robinson, H. M. R. Assessment of DNA Double Strand Break Repair Activity Using High-throughput and Quantitative Luminescence-Based Reporter Assays. J. Vis. Exp. (208), e66969, doi:10.3791/66969 (2024).