使用基于高通量和定量发光的报告基因分析评估 DNA 双链断裂修复活性

1. 报告基因底物的制备和质量控制 （QC） 注：编码报告基因底物的质粒可以在标准 大肠杆菌 菌株（例如 DH5α 和衍生物）中繁殖，并通过质粒分离回收。质粒细节（大小和抗生素抗性）见 表 1 和 图 1。 图 1：基于染色体外 NanoLuc 的 DSBR 报告基因检测示意图。 DSBR 报告基因底物的示意图，包括它们在每个来源质粒中的位置、主要序列特征以及通路特异性修复后的最终布局。通过用 XhoI/HindIII 消化从源质粒中切除不依赖切除的 MMEJ 底物核心，之后必须将帽连接到两端以产生 MMEJ 的底物。平末端 NHEJ 报告基因底物是通过用 EcoRV 从源质粒上切除产生的。切除依赖性 MMEJ、非平末端 NHEJ、长模板 HR 和 SSA 报告基因底物通过使用 I-SceI（产生非粘性末端）或 HindIII（产生粘性末端）对源质粒进行线性化而产生。短模板 HR 报告基因底物是使用 I-SceI（产生粘性末端）对源质粒进行线性化而产生的。通过靶 DSBR 途径修复每个报告基因底物，重建编码功能性 NanoLuc 的完整纳米荧光素酶 ORF。该图改编自 Rajendra 等人7。缩写： DSBR = 双股断裂修复;NanoLuc = 纳米荧光素酶;MMEJ = 微同源介导的末端连接;NHEJ = 非同源末端连接;HR = 同源重组;SSA = 单链退火;ORF = 开放阅读框。 请单击此处查看此图的较大版本。 不依赖切除的 MMEJ 报告基因底物的制备 （图 1 和 图 2A-C)ssDNA / dsDNA帽的制备（图2A）将 表 2 中列出的四种寡核苷酸分别重悬于退火缓冲液（20 mM Tris pH 7.5,50 mM NaCl 在分子生物学级水中）中，以生成 100 μM 的储备液。 ss/dsDNA 帽的退火在 0.2 mL 试管中混合步骤 1.1.1.1 中的左帽左帽各 50 μL 长寡核苷酸和短寡核苷酸（100 μM 储备液）。 对右帽寡核苷酸重复此操作。 使用热循环仪，将每个寡核苷酸混合物在 99 °C 下孵育 5 分钟，然后以 1 °C/min 的速度降至 10 °C。注意： 这将生成退火的左帽和右帽。 （QC，可选）通过电泳验证寡核苷酸退火将步骤 1.1.1.2 中的每种产物 100 ng 与步骤 1.1.1.1 中的单个寡核苷酸和低分子量 DNA 梯一起在 200 V 下在 20% 丙烯酰胺-Tris-硼酸盐-EDTA （TBE） 凝胶中电泳 80 分钟。 用含有适当荧光 DNA 染料的 TBE 电泳缓冲液对凝胶进行染色，以观察 ssDNA 和 dsDNA 至少 10-15 分钟。 在凝胶成像系统上可视化荧光（图 2A）。注意：步骤 1.1.1.3.1 至 1.1.1.3.3 用于验证瓶盖是否已正确退火。左帽和右帽的表观大小应分别为 ~120 bp 和 ~175 bp。 报告基因底物核心的纯化（图 2B）将 100 μg 报告核心质粒与 4 μL HindIII 和 4 μL XhoI（每种酶 4 U/μg 质粒）和 20 μL 10x 缓冲液混合。用双蒸水 （ddH2O） 使总体积达到 200 μL，并在 37 °C 下孵育 2 小时过夜以消化质粒。注：对于更大或更小数量的酶解，按比例缩放反应。 将消化反应在 80 °C 下孵育 20 分钟以加热灭活限制性内切酶。 向步骤 1.1.2.2 中的反应混合物中加入 40 μL 碱性磷酸酶（2 U/μg 质粒）和 27 μL 10x 缓冲液。在 37 °C 下孵育 2 小时以使质粒去磷酸化。注：根据需要放大或缩小反应规模。 向步骤 1.1.2.3 中的反应中加入 60 μL 的 6x 上样染料。在含有荧光 dsDNA 染料的 1.5% （w/v） 琼脂糖-Tris-乙酸-EDTA （TAE） 凝胶中与高分子量 DNA 分子量梯一起电泳 120 V，持续 2.5 小时或直到条带充分分离。 在凝胶成像系统上可视化荧光（图 2B）。 使用干净的手术刀从凝胶中切除报告基因核心片段 （~1.5 kb），注意不要污染载体骨架 （~2.5 kb）。 按照制造商的说明，使用凝胶提取试剂盒提取报告基因核心片段。 通过分光光度法测量 DNA 浓度和质量 （A260/280）。 报告基因底物核心与 ssDNA/dsDNA 帽的连接和最终报告基因底物的纯化（图 2C）将步骤 1.1.2.7 中的 30 μg 报告基因核心片段与步骤 1.1.2 中每个退火的左帽和右帽 3.85 μL（帽：核心 DNA 的摩尔比约为 6：1）、30 μL 10x 连接酶缓冲液和 1.5 μL T4 DNA 连接酶（20 U/μg DNA）混合。用 ddH2O 使反应总体积达到 300 μL，并在 16 °C 下孵育过夜，以将帽连接到报告基因核心片段上。注：根据需要放大或缩小反应规模。 （QC，可选）将步骤 1.1.3.1 中得到的产物与报告基因底物核心和高分子量 DNA 梯一起电泳，在含有荧光 dsDNA 染色剂的 0.7% （w/v） 琼脂糖-TAE 凝胶中，在 120 V 下电泳至少 1.5 小时。验证与连接产物相对应的条带是否以比未连接的报告基因底物核心略慢的速率迁移（图 2C）。注：此 QC 步骤用于验证帽与报告基因核心片段的连接是否已正确进行。 在步骤 1.3.1 中从消化反应中纯化 DNA。按照制造商的说明使用首选方法（例如，基于微珠或基于色谱柱的方法）。注：纯化步骤 1.1.3.3 大大减少了未连接帽的存在。 通过分光光度法测量 DNA 浓度和质量 （A260/280）。 平淡 NHEJ 报告基因底物的制备（图 1 和图 2D，E）将 100 μg 报告核心质粒与 5 μL EcoRV（5 U/μg 质粒）和 20 μL 10x 缓冲液混合。用 ddH2O 使总体积达到 200 μL，并在 37 °C 下孵育 2 小时过夜以消化质粒。注：对于更大或更小数量的酶解，按比例缩放反应。 将消化反应物在 65 °C 下孵育 20 分钟以加热灭活限制性内切酶。 向步骤 1.2.2 中的反应中加入 50 μL 的 6x 上样染料。在含有荧光 dsDNA 染料的 1.5% （w/v） 琼脂糖-TAE 凝胶中与高分子量 DNA 分子量梯一起在 120 V 下电泳 2 小时或直到条带充分分离。 在凝胶记录系统上可视化荧光（图 2D）。 使用干净的手术刀从凝胶中切除报告基因底物 （~1.7 kb），注意不要污染载体骨架 （~2.6 kb）。 按照制造商的说明，使用凝胶提取试剂盒提取报告基因核心片段（图 2E）。 通过分光光度法测量 DNA 浓度和质量 （A260/280）。 基于 I-SceI 的报告基因底物的制备（图 1）注：这些底物包括切除依赖性 MMEJ（图 2F）、非钝性 NHEJ（图 2G）、长模板 HR（图 2H）、短模板 HR（图 2I）和 SSA（图 2J）。将 100 μg 报告核心质粒与 50 μL I-SceI（5 U/μg 质粒）和 60 μL 10x 缓冲液混合。用 ddH2O 使总体积达到 600 μL，并在 37 °C 下孵育 2 小时过夜以消化质粒。注：对于更大或更小数量的酶解，按比例缩放反应。非平头 NHEJ、切除依赖性 MMEJ、长模板 HR 和 SSA 质粒也可以用 HindIII 消化，这将产生互补的粘性末端。 将消化反应物在 65 °C 下孵育 20 分钟以热灭活 I-SceI。如果使用 HindIII 进行消化，则在此步骤中将温度设置为 80 °C。 按照制造商的说明，使用首选方法（例如，基于磁珠或基于柱的方法），在步骤 1.3.2 中从灭活消化反应中纯化 DNA。 通过分光光度法测量 DNA 浓度和纯度 A260/280）。 报告基底物的质量控制将 200 ng 报告基因底物与高分子量 DNA 分子量标准一起电泳到含有荧光 dsDNA 染料的 0.7% （w/v） 琼脂糖-TAE 凝胶中，在 120 V 下电泳 2 小时或直到条带充分分辨。将原始未切割的报告质粒作为对照一起加载。 验证是否为每个报告基因底物观察到正确大小的定义条带（参见表 1 和图 2F-J）。 图 2：DSBR 报告基因底物生成的凝胶电泳分析。（A-C） 来自中间体和最终构建体的凝胶电泳分析的代表性图像，用于生成不依赖切除的 MMEJ 报告基因底物。图 （A） 和 （C） 中的相邻图像来自相同的凝胶;省略了不相关的车道。 （D，E） 来自源质粒、 EcoRV 消化产物和生成平末端 NHEJ 报告基因底物所需的凝胶提取最终构建体的凝胶电泳分析的代表性图像。 （F-J） 来自 I-SceI 消化报告基因底物的源质粒和线性化 DSBR 构建体的凝胶电泳分析的代表性图像：切除依赖性 MMEJ、非平末端 NHEJ、长模板 HR、短模板 HR、SSA。缩写： DSBR = 双股断裂修复;MMEJ = 微同源介导的末端连接;NHEJ = 非同源末端连接;HR = 同源重组;SSA = 单股退火。 请单击此处查看此图的较大版本。 2. DSBR 报告基因底物的瞬时转染 注意： 图 3 概述了测定的实验工作流程和一些可能的排列。以下方案描述了使用 HEK-293 细胞的实验，其中这些细胞用报告基因底物进行反向转染。下面的数字可以根据每个板要使用的孔数按比例放大或缩小。以下步骤针对在一个 96 孔板中进行的测定进行计算;有关其他注意事项，请参阅 讨论 。 图 3：DSBR 报告基因检测的实验工作流程。 用线性化的 DSBR 底物（编码需要通过特定 DNA 修复事件修复的 NanoLuc ORF）和 Firefly 质粒（转染对照）转染目标细胞。然后，转染后 6-24 小时，在添加 Nano-Glo 双荧光素酶试剂后，可以依次读取 Firefly 发光和 NanoLuc 发光。核心步骤的示例排列（显示在浅蓝色框中）可用于测试遗传调节（敲除、敲除或过表达）或药物治疗如何影响细胞中 DSBR 通路的熟练程度。缩写： DSBR = 双股断裂修复;NanoLuc = 纳米荧光素酶;WT = 野生型;KO = 淘汰赛。 请单击此处查看此图的较大版本。 （可选）如果评估化合物对报告基因分析的影响，则根据预定义的实验布局将溶解在载体中的化合物（例如，二甲基亚砜 [DMSO]）分配到 96 孔板的孔中。标准化所有孔的载体浓度。注意：建议进行技术重复。包括对照井（例如，仅载体）。 在 1.5 mL 试管中，在 500 μL 转染缓冲液中稀释步骤 1.1、1.2 或 1.3 中生成的 Firefly 对照质粒（对照荧光素酶）和 NanoLuc DSBR 报告基因底物（报告基因荧光素酶）。每 1 × 106 个细胞使用 0.66 μg 对照荧光素酶质粒。NanoLuc DSBR 报告基底物的使用量见 表 3 。注：组成型表达报告基因荧光素酶的阳性对照质粒可用于验证仪器设置和转染条件，或检查对报告基因荧光素酶本身的非特异性影响。作为起点，我们建议每 1 × 106 个细胞使用 0.1 μg 报告荧光素酶质粒和 0.66 μg 对照荧光素酶质粒。 按照制造商推荐的比例（例如，材料 表中描述的试剂为 1：2，μg DNA：μL 试剂）将脂质体转染试剂添加到步骤 2.2 中稀释的 DNA 中，短暂涡旋混匀，并在室温下孵育 10 分钟。 通过胰蛋白酶消化收获细胞，将它们重悬于含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的新鲜培养基中，并对其进行计数。 将 3 × 106 个细胞转移到 15 mL 试管中，并重悬于 8.5 mL 培养基中。 将步骤 2.3 中的 DNA 转染混合物添加到细胞悬液中，并通过倒置混合数次。 每孔接种 80 μL 细胞悬液（约 2.7 × 104 个细胞）。注：含有细胞和 DNA 转染混合物的悬浮液可通过手动移液或使用自动液体处理器分配到板中，以进行更高通量的实验。 在 37 °C/5% CO2 下孵育 24 小时。 3. 发光检测 试剂的制备按照制造商的说明制备和添加报告基因 （NanoLuc） 和对照 （Firefly） 荧光素酶试剂，它们为荧光素酶（分别为 Furimazine 和 5′-荧光荧光素）提供底物： 准备对照荧光素酶试剂。根据制造商的说明复溶，倒置混匀，直至荧光素酶底物完全溶解。 根据制造商的说明准备新鲜的报告荧光素酶试剂。计算添加 80 μL/孔所需的试剂量，并以 1：100 的比例将底物加入适当体积的检测缓冲液中（荧光素酶底物：缓冲液）。对于一个 96 孔板，将 88 μL 荧光素酶底物稀释到 8,800 μL 缓冲液中，并通过倒置混合。注意：这些数量包括大约 10% 的超额部分。复溶后，对照荧光素酶试剂可按照制造商的说明储存以备将来使用。报告荧光素酶试剂必须为每次使用新鲜制备。 连续检测来自对照和报告荧光素酶的发光（96 孔板）让板和荧光素酶试剂达到室温。 每孔加入 80 μL 对照荧光素酶试剂。 在轨道振荡器上以 450 rpm 的速度摇动板 3 分钟。 用发光读板器测量对照荧光素酶发光信号。注：读取 580 nm 发射（80 nm 带通滤光片）或每孔的总发光。该发光用作转染效率和细胞密度的量度，还可以告知测试处理引起的细胞毒性。 每孔加入 80 μL 报告荧光素酶试剂。注意：该试剂会抑制对照荧光素酶;它还包含报告基因荧光素酶的底物。 在轨道振荡器上以 450 rpm 的速度摇动板 3 分钟。 将板在室温下静置 7 分钟。 用发光酶标仪测量报告基因荧光素酶发光信号。注：在 470 nm（80 nm 带通滤光片）处读取发射，或者每孔的总发光。该发光提供了有关已由目标 DSBR 通路修复的报告基因底物量的信息。 导出发光读数以供下游分析。 4. 数据分析 将报告基因荧光素酶 （NanoLuc） 发光信号除以源自同一孔的对照荧光素酶 （Firefly） 发光信号，以计算检测信号。将该计算应用于所有井，如等式 （1） 所示。（1） 计算对照孔的测定信号的平均值（例如，仅载体）。 使用等式 （2） 将测试孔的分析信号归一化为对照孔平均值，以计算每孔的修复 （%）。 （2） （可选，曲线拟合）如果测试多种化合物剂量，则根据化合物浓度绘制计算的修复 （%） 图，并使用非线性回归模型拟合剂量 – 反应曲线。将此曲线用于后续的 EC50 插值。