Um método simples de flutuação fecal para o diagnóstico de nematoides zoonóticos em condições de campo e laboratório

As parasitoses gastrintestinais são um dos problemas de saúde mais comuns que acometem cães¹. Estimativas sugerem que existem ~700 milhões de cães domésticos em todo o mundo, e aproximadamente 175 milhões podem ser categorizados como free-roaming². Mais de 60 espécies de parasitas são compartilhadas entre cães e humanos, sugerindo que os cães podem ser uma fonte de infecção para humanos com esses parasitas³. Toxocara canis e Ancylostoma caninum são duas espécies parasitas que infectam cães e, acidentalmente, hospedeiros humanos. Atualmente, existem vários estudos sobre os locais onde esses helmintos são capazes de sobreviver e se reproduzir no México. A prevalência de Toxocara em cães varia de 0% a mais de 87% nos Estados Unidos, México, América Central e Caribe⁴. Toxocara canis e Ancylostoma spp., assim como outras espécies parasitárias em cães, foram previamente relatadas no México 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabela 1).

Tabela 1: Prevalência regional (%) de parasitas de cães no México de 2001 a 2020. Os resultados de investigações anteriores conduzidas de 2001 a 2020 permitiram a identificação da distribuição de parasitas caninos em vários ambientes urbanos e rurais no México. Estes estudos fornecem uma compreensão profunda dos elementos epidemiológicos favoráveis à persistência de parasitas caninos em diferentes ecossistemas, contribuindo para uma avaliação abrangente do impacto zoonótico de algumas espécies de parasitos.

Estágios do ciclo de vida de parasitas intestinais, como ovos, cistos, oocistos ou larvas podem ser encontrados em amostras de fezes. Assim, o exame do material fecal fornece informações valiosas sobre os parasitas de um animal. A necessidade de um método para detectar ovos de Ancylostomidae em fezes humanas levou ao uso do esfregaço fecal simples em 1878, que foi usado por muitos anos para detectar parasitas gastrintestinais, mas foi considerado pouco sensível. Assim, surgiu a necessidade de desenvolver melhores métodos copromicroscópicos¹⁴. Mais de 100 anos se passaram desde que a técnica de flotação para recuperação e contagem de ovos de parasitas em amostras fecais foi descrita pela primeira vez¹⁵. Desde então, vários métodos e variantes da técnica de flotação têm sido considerados um padrão para a detecção de alguns parasitas em seus hospedeiros.

Por exemplo, Lane descreveu um método em 1924 envolvendo a técnica de flotação centrífuga direta, que integra centrifugação seguida de flutuação do sedimento em uma solução saturada de cloreto de sódio com SpG 1,2 em 1 g (Lane) ou 10 g (modificação de Stoll). A técnica de flotação foi posteriormente modificada utilizando-se soluções com diferentes SpG¹⁴. Em 1939, Gordon e Whitlock relataram as desvantagens da técnica de Stoll devido à interferência de detritos na visualização de ovos de parasitas e desenvolveram o método quantitativo conhecido como McMaster¹⁶. Em 1979, O’Grady e Slocombe demonstraram que a gravidade específica da solução, o tempo e as malhas dos filtros afetam a precisão da detecção de ovos pela técnica de flotação¹⁷. Durante as últimas décadas, devido a várias modificações que foram feitas na técnica de flotação, há uma necessidade urgente de padronização dos métodos de flotação. Atualmente, a detecção de helmintos caninos no contexto da prevenção de parasitas zoonóticos é necessária para a aplicação de tratamentos anti-helmínticos apropriados para limitar a contaminação ambiental com estágios infecciosos de nematoides zoonóticos¹⁸.

Dentre os métodos qualitativos, a técnica de flutuação fecal é amplamente utilizada e aceita por não necessitar de muitos equipamentos, ser simples, barata e reprodutível; no entanto, tem uma grande desvantagem na falta de sensibilidade quando a intensidade da infecção é baixa¹⁹. A capacidade de revelar a presença de um maior número de elementos parasitários, como ovos, oocistos, cistos ou larvas de nematoides, é geralmente determinada pela densidade da solução²⁰.

Relatos prévios compararam técnicas coproparasitológicas para a detecção de ovos de nematoides caninos. Com relação à detecção de protozoários móveis, são utilizados esfregaços fecais diretos; enquanto os métodos de sedimentação são úteis para diagnosticar ovos pesados de parasitas como trematódeos²¹. Um dos testes diagnósticos de campo mais utilizados é o esfregaço fecal. No entanto, o baixo nível de sensibilidade dessa técnica pode ser atribuído ao fato de conter detritos que interferem na detecção de ovos do parasita. Ao incorporar uma etapa de peneiramento juntamente com soluções que fornecem a SpG adequada, o método de flotação oferece uma observação mais clara e menos desordenada dos ovos de ascarida e ancilostomíase. Isso leva a um processo mais preciso e eficiente para o rastreamento microscópico²². Da mesma forma, técnicas de flotação simples e centrífuga direta são muito comumente utilizadas para recuperar ovos e oocistos do^parasita14. Os métodos clássicos de flotação podem ser considerados qualitativos ou quantitativos dependendo do uso de uma câmara de contagem como o método de McMaster¹⁵. No entanto, como a técnica de flotação tem baixa sensibilidade e se concentra na detecção de parasitas no período de patente, resultados negativos não devem ser considerados conclusivos. No entanto, a precisão não depende apenas do procedimento de preservação de amostras fecais ou do SpG das soluções de flotação, mas também depende da proficiência técnica e experiência na realização de exames fecais do usuário.

Consequentemente, outros métodos têm sido explorados para a detecção de parasitas caninos nas fezes. Tem sido geralmente reconhecido que uma das abordagens mais utilizadas para o diagnóstico de helmintos intestinais em cães é a técnica FLOTAC, um método multivalente, sensível e acurado que produz resultados precisos e confiáveis para o diagnóstico de A. caninum em cães quando comparado a um protocolo de flutuação em tubo e à técnica de McMaster19^{, 23º}. Os métodos de sedimentação são úteis para a recuperação de ovos de fluke, ovos embrionados de nematoides e a maioria dos ovos de tênia, que não podem ser recuperados na superfície de uma solução de flutuação porque essas estruturas não flutuam²⁴. Um método que tem se mostrado superior às técnicas de flotação/sedimentação é o método de Flotação Centrífuga Dupla Modificada, pois permite a detecção de ovos de cestoide nas fezes, é menos demorado, separa ovos de Anoplocephala de detritos fecais e diminui a cristalização²⁵. Além disso, essa técnica tem sido utilizada com sucesso para detectar ovos de ascarid com alta^{sensibilidade26}. No entanto, algumas dessas técnicas e métodos centrífugos mencionados, como o Ovassay, ao contrário do protocolo de flotação que propomos neste estudo, requerem a preservação da amostra em reagentes como formalina, kits comerciais, processamento de amostras em condições de laboratório e o uso de reagentes como o sulfato de zinco²⁷, que são caros e requerem procedimentos especiais de descarte para evitar toxicidade ambiental.

O uso de técnicas que aumentem a sensibilidade do método de flotação pela adição de soluções com alta SpG tem sido favorecido recentemente. No entanto, deve-se considerar que a desvantagem dessas soluções é o aumento de detritos no preparo final e, consequentemente, a detecção imprecisa de ovos do parasita. Além disso, a disponibilidade comercial de materiais, reagentes, custo, questões de impacto ambiental e dificuldade de uso de métodos centrífugos afetam a seleção de uma técnica de flotação¹⁴, o que pode ser desafiador em condições de campo em contraste com o protocolo que apresentamos neste trabalho. O preparo das soluções de flotação com sal de cozinha é vantajoso em relação à utilização do açúcar, pois, em condições de campo, o açúcar atrai insetos como vespas e abelhas e as preparações tornam-se pegajosas. Além disso, soluções como fenol, que é adicionado a soluções de açúcar para evitar aderência, ou ZnSO₄são complexas de descartar corretamente de acordo com as diretrizes de proteção ambiental e não podem ser descartadas no campo; ao contrário de uma solução de sal de cozinha.

O objetivo deste manuscrito é demonstrar os passos para a detecção de ovos de T. canis e Ancylostoma spp., em amostras fecais, utilizando uma adaptação da técnica de flutuação simples em condições de campo e laboratório. Seguindo o protocolo aqui descrito e utilizando um microscópio com bateria reserva, o diagnóstico desses parasitas zoonóticos caninos em áreas rurais e suburbanas é possível quando não há equipamentos e infraestrutura laboratorial disponíveis. O método de flutuação simples descrito neste trabalho pode fornecer resultados rápidos e é uma técnica não invasiva e custo-efetiva para triagem de rotina.