Eine einfache Kotflotationsmethode zur Diagnose zoonotischer Nematoden unter Feld- und Laborbedingungen

Magen-Darm-Parasiten sind eines der häufigsten Gesundheitsprobleme, die Hunde betreffen¹. Schätzungen gehen davon aus, dass es weltweit ~700 Millionen Haushunde gibt, und etwa 175 Millionen können als freilaufend eingestuft werden². Mehr als 60 Parasitenarten werden zwischen Hunden und Menschen geteilt, was darauf hindeutet, dass Hunde eine Infektionsquelle für Menschen mit diesen Parasiten sein könnten³. Toxocara canis und Ancylostoma caninum sind zwei parasitäre Arten, die Hunde und versehentlich auch menschliche Wirte infizieren. Derzeit gibt es mehrere Studien über die Orte, an denen diese Helminthen in Mexiko überleben und sich vermehren können. Die Prävalenz von Toxocara bei Hunden variiert zwischen 0 % und über 87 % in den Vereinigten Staaten, Mexiko, Mittelamerika und der Karibik⁴. Toxocara canis und Ancylostoma spp. sowie andere parasitäre Arten bei Hunden wurden zuvor in Mexiko ^berichtet 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabelle 1).

Tabelle 1: Regionale Prävalenz (%) von Hundeparasiten in Mexiko von 2001 bis 2020. Die Ergebnisse früherer Untersuchungen, die von 2001 bis 2020 durchgeführt wurden, haben die Identifizierung der Verbreitung von Hundeparasiten in verschiedenen städtischen und ländlichen Gebieten Mexikos ermöglicht. Diese Studien bieten ein tiefes Verständnis der epidemiologischen Elemente, die für die Persistenz von Hundeparasiten in verschiedenen Ökosystemen förderlich sind, und tragen zu einer umfassenden Bewertung der zoonotischen Auswirkungen einiger Parasitenarten bei.

Lebenszyklusstadien von Darmparasiten wie Eiern, Zysten, Oozysten oder Larven können in Stuhlproben gefunden werden. So liefert die Untersuchung von Fäkalien wertvolle Informationen über die Parasiten eines Tieres. Die Notwendigkeit einer Methode zum Nachweis von Ancylostomidae-Eiern im menschlichen Kot führte 1878 zur Verwendung des einfachen Kotabstrichs, der viele Jahre lang zum Nachweis von Magen-Darm-Parasiten verwendet wurde, aber als nicht sehr empfindlich galt. Daher entstand die Notwendigkeit, bessere kopromikroskopische Methoden zu entwickeln¹⁴. Mehr als 100 Jahre sind vergangen, seit die Flotationstechnik zur Gewinnung und Zählung von Parasiteneiern in Kotproben erstmals beschrieben wurde¹⁵. Seitdem gelten mehrere Methoden und Varianten der Flotationstechnik als Standard für den Nachweis einiger Parasiten in ihren Wirten.

Zum Beispiel beschrieb Lane 1924 ein Verfahren mit der direkten Zentrifugalflotationstechnik, bei der das Sediment zentrifugiert und anschließend in einer gesättigten Natriumchloridlösung mit SpG 1,2 in 1 g (Lane) oder 10 g (Stoll-Modifikation) aufgewirbelt wird. Die Flotationstechnik wurde anschließend durch die Verwendung von Lösungen mit unterschiedlichem SpG¹⁴ modifiziert. Im Jahr 1939 berichteten Gordon und Whitlock über die Nachteile von Stolls Technik aufgrund von Störungen durch Detritus bei der Visualisierung von Parasiteneiern und entwickelten die quantitative Methode, die als McMaster¹⁶ bekannt ist. Im Jahr 1979 zeigten O’Grady und Slocombe, dass das spezifische Gewicht der Lösung, der Zeitpunkt und die Maschenweiten der Siebe die Genauigkeit der Eiererkennung mit der Flotationstechnik^{beeinflussen 17}. Da in den letzten Jahrzehnten mehrere Modifikationen an der Flotationstechnik vorgenommen wurden, besteht ein dringender Bedarf an einer Standardisierung der Flotationsmethoden. Derzeit ist der Nachweis von Helmintheninfektionen bei Hunden im Rahmen der Prävention von zoonotischen Parasiten erforderlich, um geeignete Anthelminthika-Behandlungen anzuwenden, um die Umweltkontamination mit infektiösen Stadien zoonotischer Nematoden zu begrenzen¹⁸.

Unter den qualitativen Methoden ist die Kotflotationstechnik weit verbreitet und akzeptiert, da sie nicht viel Ausrüstung erfordert, einfach, kostengünstig und reproduzierbar ist. Es hat jedoch einen großen Nachteil, da es ihm an Empfindlichkeit mangelt, wenn die Intensität der Infektion niedrig^{ist 19}. Die Fähigkeit, das Vorhandensein einer größeren Anzahl parasitärer Elemente wie Eier, Oozysten, Zysten oder Nematodenlarven aufzudecken, wird normalerweise durch die Dichte der Lösung^{bestimmt 20}.

Frühere Berichte haben koproparasitologische Techniken zum Nachweis von Nematodeneiern bei Hunden verglichen. Im Hinblick auf den Nachweis von beweglichen Protozoen werden direkte Stuhlabstriche verwendet; während Sedimentationsmethoden nützlich sind, um schwere Eier von Parasiten wie Trematoden zu diagnostizieren²¹. Einer der am weitesten verbreiteten feldbasierten diagnostischen Tests ist die Stuhlabstrichmethode. Die geringe Empfindlichkeit dieser Technik kann jedoch auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass sie Schmutz enthält, der die Erkennung von Parasiteneiern stört. Durch die Integration eines Siebschritts zusammen mit Lösungen, die den richtigen SpG liefern, bietet die Flotationsmethode eine klarere und weniger überladene Beobachtung von Ascarid- und Hakenwurmeiern. Dies führt zu einem präziseren und effizienteren Verfahren für das mikroskopische Screening²². Ebenso werden einfache Flotations- und direkte Zentrifugalflotationstechniken sehr häufig verwendet, um Parasiteneier und Oozysten zu gewinnen¹⁴. Die klassischen Flotationsmethoden können je nach Verwendung einer Zählkammer als qualitativ oder quantitativ angesehen werden, wie z. B. die McMaster-Methode¹⁵. Da die Flotationstechnik jedoch eine geringe Empfindlichkeit aufweist und sich auf den Nachweis von Parasiten während der Patentlaufzeit konzentriert, sollten negative Ergebnisse nicht als schlüssig angesehen werden. Die Genauigkeit hängt jedoch nicht nur vom Konservierungsverfahren von Kotproben oder der SpG von Flotationslösungen ab, sondern auch von der technischen Kompetenz und Erfahrung in der Durchführung von Kotuntersuchungen des Anwenders.

Daher wurden andere Methoden zum Nachweis von Hundeparasiten im Kot erforscht. Es ist allgemein anerkannt, dass einer der am weitesten verbreiteten Ansätze für die Diagnose von intestinalen Helmintheninfektionen bei Hunden die FLOTAC-Technik ist, eine multivalente, empfindliche und genaue Methode, die im Vergleich zu einem Flotationsprotokoll in einem Röhrchen und der McMaster-Technik genaue und zuverlässige Ergebnisse für die Diagnose von A. caninum bei Hunden liefert^{19. 23}. Urheberrecht Sedimentationsmethoden sind nützlich für die Rückgewinnung von Egeleiern, embryonierten Nematodeneiern und den meisten Bandwurmeiern, die nicht an der Oberfläche einer Flotationslösung gewonnen werden können, da diese Strukturen nicht schwimmen²⁴. Eine Methode, die sich als überlegen gegenüber Flotations-/Sedimentationstechniken erwiesen hat, ist die modifizierte Doppelzentrifugalflotationsmethode, da sie den Nachweis von Cestode-Eiern im Kot ermöglicht, weniger zeitaufwändig ist, Anoplocephala-Eier von Fäkalien trennt und die Kristallisation verringert²⁵. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich zum Nachweis von Askarideneiern mit hoher Empfindlichkeit eingesetzt²⁶. Einige dieser oben genannten Techniken und Zentrifugalmethoden wie der Ovassay erfordern jedoch im Gegensatz zu dem in dieser Studie vorgeschlagenen Flotationsprotokoll die Probenkonservierung in Reagenzien wie Formalin, kommerziellen Kits, Probenverarbeitung unter Laborbedingungen und die Verwendung von Reagenzien wie Zinksulfat²⁷, die teuer sind und spezielle Entsorgungsverfahren erfordern, um Umwelttoxizität zu vermeiden.

Die Verwendung von Techniken, die die Empfindlichkeit der Flotationsmethode durch Zugabe von Lösungen mit hohem SpG erhöhen, wurde in letzter Zeit bevorzugt. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Nachteil dieser Lösungen die Zunahme von Schmutz in der Endzubereitung und damit die ungenaue Erkennung von Parasiteneiern ist. Darüber hinaus beeinflussen die kommerzielle Verfügbarkeit von Materialien, Reagenzien, Kosten, Umweltverträglichkeitsfragen und die Schwierigkeit der Anwendung von Zentrifugalmethoden die Auswahl einer Flotationstechnik¹⁴, die unter Feldbedingungen im Gegensatz zu dem Protokoll, das wir in dieser Arbeit vorstellen, eine Herausforderung darstellen kann. Die Herstellung der Flotationslösungen mit Speisesalz ist gegenüber der Verwertung von Zucker vorteilhaft, da Zucker unter Feldbedingungen Insekten wie Wespen und Bienen anlockt und Präparate klebrig werden. Darüber hinaus sind Lösungen wie Phenol, das Zuckerlösungen zugesetzt wird, um Klebrigkeit zu vermeiden, oder ZnSO₄gemäß den Umweltschutzrichtlinien komplex zu entsorgen und können nicht vor Ort entsorgt werden. im Gegensatz zu einer Kochsalzlösung.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zum Nachweis von T . canis – und Ancylostoma spp.-Eiern in Stuhlproben unter Verwendung einer Anpassung der einfachen Flotationstechnik unter Feld- und Laborbedingungen zu demonstrieren. Nach dem hier beschriebenen Protokoll und unter Verwendung eines Mikroskops mit einer Pufferbatterie ist die Diagnose dieser tierischen Parasiten in ländlichen und vorstädtischen Gebieten möglich, wenn keine Laborgeräte und -infrastruktur verfügbar sind. Die in dieser Arbeit beschriebene einfache Flotationsmethode kann schnelle Ergebnisse liefern und ist eine nicht-invasive und kostengünstige Technik für das Routine-Screening.