Terapia fotodinâmica antimicrobiana mediada por curcuminóides em um modelo murino de candidíase oral
Özet
Este protocolo descreve a aplicação da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) em um modelo murino de candidíase oral. A aPDT foi realizada usando uma mistura solúvel em água de curcuminóides e luz LED azul.
Abstract
A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) tem sido extensivamente investigada in vitro, e modelos animais pré-clínicos de infecções são adequados para avaliar tratamentos alternativos antes de ensaios clínicos. Este estudo descreve a eficácia da aPDT em um modelo murino de candidíase oral. Quarenta camundongos foram imunossuprimidos com injeções subcutâneas de prednisolona, e suas línguas foram inoculadas com swab oral previamente embebido em suspensão celular de C. albicans . A tetraciclina foi administrada via água potável durante o curso do experimento. Cinco dias após a inoculação fúngica, os camundongos foram distribuídos aleatoriamente em oito grupos; Um nono grupo de camundongos não infectados não tratados foi incluído como controle negativo (n = 5). Três concentrações (20 μM, 40 μM e 80 μM) de uma mistura de curcuminóides foram testadas com luz LED azul (89,2 mW/cm2; ~455 nm) e sem luz (grupos C+L+ e C+L-, respectivamente). Animais leves (C-L+), sem tratamento (C-L-) e sem infecção foram avaliados como controles. Os dados foram analisados por ANOVA de Welch e Games-Howell (α = 0,05). A candidíase oral foi estabelecida em todos os animais infectados e visualizada macroscopicamente através da presença de manchas brancas características ou pseudomembranas no dorso da língua. Cortes histopatológicos confirmaram grande presença de leveduras e filamentos limitados à camada queratinizada do epitélio no grupo C-L-, e a presença de células fúngicas foi visualmente diminuída nas imagens obtidas de camundongos submetidos à aPDT com curcuminóides de 40 μM ou 80 μM. A aPDT mediada por 80 μM de curcuminóides promoveu uma redução de 2,47 log10 na contagem de colônias em comparação com aquelas no grupo C-L- (p = 0,008). Todos os outros grupos não apresentaram redução estatisticamente significativa no número de colônias, incluindo os grupos fotossensibilizador (C+L-) ou somente luz (C-L+). A aPDT mediada por curcuminóides reduziu a carga fúngica das línguas de camundongos.
Introduction
A candidíase oral (CO) é a principal infecção fúngica da cavidade oral; é causada pelo crescimento excessivo de Candida spp. Os fatores predisponentes para FO incluem disfunção endócrina, uso de antibióticos de amplo espectro, radioterapia e quimioterapia, deficiências nutricionais, xerostomia (baixo fluxo salivar), uso de próteses dentárias, falta de higiene e, principalmente, imunossupressão1. Entre as espécies de Candida , Candida albicans é a mais prevalente e virulenta; É encontrada como uma espécie comensal no corpo humano e como um patógeno oportunista. C. albicans tem a capacidade de alterar sua morfologia de leveduras comensais (blastóporos) para filamentos patogênicos (hifas e pseudo-hifas)2. As formas filamentosas, especialmente as hifas, podem invadir o epitélio do hospedeiro por endocitose ou penetração ativa, causandoinfecção3. Outros fatores de virulência de C. albicans incluem adesão, formação de biofilme e secreção de enzimas e toxinas lipolíticas e hidrolíticas, como lipases, fosfolipases, proteinases e candidalisina4.
O tratamento da CO envolve o uso de antifúngicos, especialmente polienos e azólicos tópicos (nistatina e miconazol)5. No entanto, apresentam eficácia em curto prazo, sendo frequente a recorrência. Além disso, o uso excessivo de antifúngicos tem gerado o problema do desenvolvimento e disseminação de resistência antifúngica6. Portanto, terapias alternativas são necessárias, como a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa), que combina um fotossensibilizador (PS) e luz em um comprimento de onda apropriado (o mesmo da absorção do PS) na presença de oxigênio. As PSs são ligadas ou absorvidas pelas células e, quando ativadas pela luz, produzem espécies reativas de oxigênio (EROs) tóxicas para as células sensibilizadas7.
Na aPDT, um dos fotossensibilizadores (PSs) empregados é a curcumina (CUR), um composto natural extraído dos rizomas da planta cúrcuma (Curcuma longa L.). A curcumina possui inúmeros atributos terapêuticos, incluindo capacidades anti-inflamatórias, antioxidantes, anticancerígenas e antimicrobianas 8,9. Uma investigação anterior constatou que a TFD utilizando CUR efetivamente diminuiu C. albicans em um modelo murino de candidíase oral sem causar qualquer dano aos tecidos do hospedeiro10. CUR é o principal curcuminóide extraído da cúrcuma, Mas outros polifenóis, como demetoxicurcumina e bis-demetoxicurcumina, também são encontrados nesta planta. A aPDT mediada por curcuminóides demonstrou atividade antibacteriana contra biofilmes de Staphylococcus aureus cultivados em cateteres11. No entanto, até onde sabemos, sua atividade antifúngica contra C. albicans permanece obscura. Portanto, neste estudo, avaliamos a aPDT mediada por um sal curcuminóide contra C. albicans em um modelo murino de CO.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans tem sido associada a infecções orais e esofágicas em indivíduos com estado de imunocomprometimento, diabetes mellitus, uso prolongado de antibióticos e higiene oral deficiente 1,3. O estudo de doenças infecciosas humanas requer investigações in vitro e in vivo antes que os ensaios clínicos possam ser projetados com segurança e precisão. O presente estudo descreve um método para estabelecer um modelo murino de CO,…
Acknowledgements
Os autores agradecem o apoio financeiro da FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, processo número FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) e 2008/00601-6. Agradecemos também à Dra. Ana Paula Silva por fornecer as informações sobre o sal solúvel em água à base de CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
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