Terapia fotodinámica antimicrobiana mediada por curcuminoides en un modelo murino de candidiasis oral
Özet
Este protocolo describe la aplicación de la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) en un modelo murino de candidiasis oral. La aPDT se realizó utilizando una mezcla soluble en agua de curcuminoides y luz LED azul.
Abstract
La terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT) se ha investigado ampliamente in vitro, y los modelos animales preclínicos de infecciones son adecuados para evaluar tratamientos alternativos antes de los ensayos clínicos. Este estudio describe la eficacia de la aPDT en un modelo murino de candidiasis oral. Cuarenta ratones fueron inmunosuprimidos con inyecciones subcutáneas de prednisolona, y sus lenguas fueron inoculadas utilizando un hisopo oral previamente empapado en una suspensión celular de C. albicans . La tetraciclina se administró a través del agua potable durante el transcurso del experimento. Cinco días después de la inoculación fúngica, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en ocho grupos; Un noveno grupo de ratones no infectados no tratados se incluyó como control negativo (n = 5). Se probaron tres concentraciones (20 μM, 40 μM y 80 μM) de una mezcla de curcuminoides con una luz LED azul (89,2 mW/cm2; ~455 nm) y sin luz (grupos C+L+ y C+L-, respectivamente). Se evaluaron como controles la luz sola (C-L+), ningún tratamiento (C-L-) y los animales sin infección. Los datos se analizaron mediante ANOVA de Welch y pruebas de Games-Howell (α = 0,05). La candidiasis oral se estableció en todos los animales infectados y se visualizó macroscópicamente a través de la presencia de manchas blancas características o pseudomembranas en el dorso de las lenguas. Los cortes histopatológicos confirmaron una gran presencia de levaduras y filamentos limitados a la capa queratinizada del epitelio en el grupo C-L-, y la presencia de células fúngicas disminuyó visualmente en las imágenes obtenidas de ratones sometidos a aPDT con curcuminoides de 40 μM u 80 μM. La aPDT mediada por 80 μM de curcuminoides promovió una reducción de 2,47 log10 en el recuento de colonias en comparación con las del grupo C-L- (p = 0,008). Todos los demás grupos no mostraron una reducción estadísticamente significativa en el número de colonias, incluidos los grupos fotosensibilizadores (C+L-) o los grupos de luz sola (C-L+). La aPDT mediada por curcuminoides redujo la carga fúngica de las lenguas de los ratones.
Introduction
La candidiasis oral (OC) es la principal infección fúngica de la cavidad oral; es causada por el crecimiento excesivo de Candida spp. Los factores predisponentes para el CO incluyen la disfunción endocrina, el uso de antibióticos de amplio espectro, la radioquimioterapia y la quimioterapia, las deficiencias nutricionales, la xerostomía (bajo flujo salival), el uso de dentaduras postizas, la mala higiene y, especialmente, la inmunosupresión1. Entre las especies de Candida, Candida albicans es la más prevalente y virulenta; Se encuentra como especie comensal en el cuerpo humano y como patógeno oportunista. C. albicans tiene la capacidad de cambiar su morfología de levaduras comensales (blastóforos) a filamentos patógenos (hifas y pseudohifas)2. Las formas filamentosas, especialmente las hifas, pueden invadir el epitelio del huésped por endocitosis o penetración activa, causando infección3. Otros factores de virulencia de C. albicans incluyen la adhesión, la formación de biopelículas y la secreción de enzimas y toxinas lipolíticas e hidrolíticas, como lipasas, fosfolipasas, proteinasas y candidalisina4.
Los tratamientos antifúngicos implican el uso de agentes antifúngicos, especialmente polienos y azoles tópicos (nistatina y miconazol)5. Sin embargo, solo muestran eficacia a corto plazo y la recurrencia es frecuente. Además, el uso excesivo de antifúngicos ha dado lugar al problema del desarrollo y la propagación de la resistencia a los antifúngicos6. Por lo tanto, se necesitan terapias alternativas, como la terapia fotodinámica antimicrobiana (aPDT), que combina un fotosensibilizador (PS) y luz a una longitud de onda adecuada (la misma que la de la absorción de PS) en presencia de oxígeno. Las PS se unen a las células o son absorbidas por ellas y, cuando son activadas por la luz, producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que son tóxicas para las células sensibilizadas7.
En la aPDT, uno de los fotosensibilizadores (PS) empleados es la curcumina (CUR), un compuesto natural extraído de los rizomas de la planta de cúrcuma (Curcuma longa L.). La curcumina posee numerosos atributos terapéuticos, incluyendo capacidades antiinflamatorias, antioxidantes, anticancerígenas y antimicrobianas 8,9. Una investigación previa encontró que la aPDT que utiliza CUR disminuyó efectivamente C. albicans en un modelo murino de candidiasis oral sin causar ningún daño a los tejidos del huésped10. El CUR es el principal curcuminoide extraído de la cúrcuma, pero otros polifenoles, como la demetoxicurcumina y la bis-demetoxicurcumina, también se encuentran en esta planta. La aPDT mediada por curcuminoides demostró actividad antibacteriana contra biopelículas de Staphylococcus aureus cultivadas en catéteres11. Sin embargo, hasta donde sabemos, su actividad antifúngica contra C. albicans sigue sin estar clara. Por lo tanto, en este estudio, evaluamos la aPDT mediada por una sal curcuminoide contra C. albicans en un modelo murino de CO.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans se ha asociado con infecciones orales y esofágicas en individuos con estado inmunocomprometido, diabetes mellitus, uso prolongado de antibióticos y mala higiene bucal 1,3. El estudio de las enfermedades infecciosas humanas requiere investigaciones in vitro e in vivo antes de que los ensayos clínicos puedan diseñarse de forma segura y precisa. El presente estudio describe un método para establecer un modelo murino de CO,…
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero de la FAPESP (Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo, número de proceso FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) y 2008/00601-6. También agradecemos a la Dra. Ana Paula Silva por brindar la información sobre la sal soluble en agua a base de CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
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