一种基于小鼠胚胎干细胞的优化反向多转染技术，用于快速探索核酸比率

将 DNA 和 RNA 递送至哺乳动物细胞是生物医学研究的核心支柱¹.将外源核酸 （NA） 引入哺乳动物细胞的常用方法是瞬时转染 ^2,3。该技术依赖于将 NA 与能够将其递送至受体细胞的市售转染试剂混合。通常，NA 通过正向转染递送，其中粘附在二维表面的细胞接受转染复合物。虽然对最常见的已建立细胞系进行正向转染是稳健的，并且实验方案已广泛发表，但更多具有非单层形态的利基细胞类型不容易转染，从而限制了可递送的 NA 量和接收它的细胞数量。

多能干细胞 （PSC） 是理解发育的有吸引力的模型，也是再生医学的工具，因为它们能够无限分裂并产生任何身体细胞类型。对于小鼠 PSC （mPSC），具有 2 种抑制剂和 LIF （2i/LIF） 的常规体外培养条件保持圆顶状集落形态，直接限制暴露于正向转染的细胞数量 ^4,5,6。为了解决这个问题，可以进行反向转染：将细胞加入含有培养基和转染试剂的培养皿中，而不是将转染试剂添加到贴壁细胞^{中 7}。虽然这增加了暴露于试剂的细胞数量，但也需要同时传代和转染细胞。

除了简单的单NA转染之外，研究人员通常还致力于在体外将几种NA构建体递送至细胞群中。这通常通过共转染实现，其中 NA 以给定比例（1：1、9：1 等）混合，然后与所选转染试剂^{结合 8}。这会产生 NA 和试剂的混合物，该混合物保留了 NA 彼此之间的原始比例 – 虽然处理中的细胞可能接受不同量的这种混合物，但它们都接受相同的比例⁹。虽然当知道所需的零件比例时，这是有利的，但提前确定该比例可能是劳动密集型的，每个比率都构成不同的条件。一种替代方法是进行“多转染”，即将单个 NA 与转染试剂彼此独立地混合⁹。通过组合含有单个 NA 的转染复合物（而不是在创建复合物之前组合 NA），研究人员可以在单次转染实验中探索各种 NA 化学计量学⁹。这在预计多个 NA 的产物会相互作用的情况下特别有价值，例如与诱导型转录系统或具有内置^{反馈的系统 1,10,11}。然而，要有效地做到这一点，需要高转染效率。事实上，随着独特转染 NA 数量的增加，给定细胞接收所有所需 NA 的概率呈指数下降 ^9,12。

以下报告描述了使用基于阳离子脂质的转染试剂的 mPSC 反向转染方案，其中细胞暴露于试剂-NA 混合物中最多 5 分钟，以最大限度地提高活力并最大限度地减少典型培养条件之外的时间。将该方案与这些细胞的标准正向转染进行比较，显示出更高的转染效率和存活转染细胞总数的增加。通过将这种反向转染与涉及简单荧光报告基因的三质粒多转染相结合，证明了以高转染效率筛选 NA 比率的扩展潜力。