Özet

Metabolómica dirigida en células primarias raras

Published: February 23, 2024
doi:

Özet

Aquí, presentamos un protocolo para medir de manera precisa y confiable los metabolitos en tipos de células raras. Las mejoras técnicas, incluido un fluido de vaina modificado para la clasificación de células y la generación de muestras en blanco relevantes, permiten una cuantificación completa de metabolitos con una entrada de solo 5000 células por muestra.

Abstract

La función celular depende críticamente del metabolismo, y la función de las redes metabólicas subyacentes se puede estudiar midiendo los intermedios de moléculas pequeñas. Sin embargo, la obtención de mediciones precisas y fiables del metabolismo celular, especialmente en tipos de células raras como las células madre hematopoyéticas, ha requerido tradicionalmente la agrupación de células de múltiples animales. Un protocolo ahora permite a los investigadores medir metabolitos en tipos de células raras utilizando solo un ratón por muestra, al tiempo que generan múltiples réplicas para tipos de células más abundantes. Esto reduce el número de animales que se requieren para un proyecto determinado. El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave con respecto a los protocolos metabolómicos tradicionales, como el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en acetonitrilo y la utilización de una cuantificación dirigida con un uso riguroso de estándares internos, lo que permite mediciones más precisas y completas del metabolismo celular. A pesar del tiempo necesario para el aislamiento de células individuales, la tinción fluorescente y la clasificación, el protocolo puede preservar en gran medida las diferencias entre los tipos de células y los tratamientos farmacológicos.

Introduction

El metabolismo es un proceso biológico esencial que ocurre en todas las células vivas. Los procesos metabólicos implican una vasta red de reacciones bioquímicas que están estrechamente reguladas e interconectadas, lo que permite a las células producir energía y sintetizarbiomoléculas esenciales. Para comprender la función de las redes metabólicas, los investigadores miden los niveles de intermediarios de moléculas pequeñas dentro de las células. Estos intermediarios sirven como indicadores importantes de la actividad metabólica y pueden revelar información crítica sobre la función celular.

La espectrometría de masas (MS) es la opción más popular para la detección específica de metabolitos en muestras complejas 1,2. La resonancia magnética nuclear (RMN) tiene ventajas en la cuantificación absoluta de compuestos y la elucidación de estructuras, pero la EM a menudo puede resolver más componentes en mezclas complejas como biofluidos o extractos celulares. La mayoría de las veces, la EM se combina con la separación previa del compuesto mediante electroforesis capilar (CE), cromatografía de gases (GC) o cromatografía líquida (LC)3. La elección de la plataforma de separación depende principalmente de la gama de metabolitos objetivo y del tipo de muestra y, en un entorno real, de la disponibilidad de máquinas y experiencia. Las tres plataformas de separación tienen una amplia gama de metabolitos adecuados, pero diferentes limitaciones. En resumen, la CE solo puede separar moléculas cargadas y requiere mucha experiencia para implementar un análisis robusto de una gran cantidad de muestras4. La GC se limita a moléculas que son lo suficientemente pequeñas y apolares como para evaporarse antes dedescomponerse. Teniendo en cuenta todas las columnas de LC disponibles en el mercado, dos metabolitos cualesquiera pueden separarse mediante esta tecnología5. Sin embargo, muchos métodos de LC exhiben menos poder de resolución que los métodos CE o GC de longitud similar.

La cantidad típica de material de partida para las mediciones metabolómicas suele estar en el rango de 5 x 105 a 5 x 107 células por muestra, 5-50 mg de tejido húmedo o 5-50 μL de líquido corporal6. Sin embargo, puede ser difícil obtener tales cantidades de material de partida cuando se trabaja con células primarias de tipos celulares raros, como por ejemplo las células madre hematopoyéticas (CMH) o las células tumorales circulantes. Estas células a menudo están presentes en cantidades muy bajas y no se pueden cultivar sin comprometer las características celulares críticas.

Las HSC y las células progenitoras multipotentes (MPP) son las células menos diferenciadas del sistema hematopoyético y producen continuamente nuevas células sanguíneas a lo largo de la vida de un organismo. La regulación de la hematopoyesis es de relevancia clínica en afecciones como la leucemia y la anemia. A pesar de su importancia, las HSC y las MPP se encuentran entre las células más raras dentro del sistema hematopoyético. De un solo ratón, típicamente, se pueden aislar alrededor de 5000 HSC 7,8,9. Dado que los métodos metabolómicos tradicionales requieren más material de entrada, a menudo era necesario agrupar células de varios ratones para analizar tipos de células raras10,11.

Aquí, nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que permitiera la medición de metabolitos en tan solo 5000 células por muestra para permitir la generación de datos metabolómicos a partir de las HSC de un solo ratón12. Al mismo tiempo, este método permite generar múltiples réplicas a partir de un solo ratón para tipos celulares más abundantes como los linfocitos. Este enfoque reduce el número de animales necesarios para un proyecto determinado, contribuyendo así a las “3R” (reducción, reemplazo, refinamiento) de los experimentos con animales.

Los metabolitos en las células pueden tener tasas de renovación muy altas, a menudo del orden de segundos13. Sin embargo, la preparación de muestras para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede llevar horas, y la clasificación FACS en sí misma puede llevar de minutos a horas, lo que lleva a posibles alteraciones en el metaboloma debido a condiciones no fisiológicas. Algunos de los reactivos utilizados en este protocolo (como el tampón de lisis de amonio-cloruro-potasio [ACK]) pueden tener efectos similares. Estas condiciones pueden causar estrés celular y afectar los niveles y proporciones de metabolitos dentro de las células, lo que lleva a mediciones inexactas o sesgadas del metabolismo celular 14,15,16. Los cambios metabólicos debidos a la preparación de la muestra a veces se denominan artefactos de clasificación. Los largos protocolos de digestión y los reactivos agresivos que pueden ser necesarios para producir suspensiones unicelulares a partir de tejidos duros o duros pueden agravar este problema. Es probable que los cambios que se pueden producir dependan del tipo de célula y de la condición de procesamiento. La naturaleza precisa de los cambios sigue siendo desconocida, ya que no se puede medir el estado metabólico de las células no perturbadas en el tejido vivo.

El protocolo presentado aquí implica varias diferencias clave en comparación con los métodos tradicionales, a saber, el uso de 5 g/L de NaCl como fluido de vaina, la clasificación directa en tampón de extracción, la inyección de grandes volúmenes de muestra en cromatografía líquida de interacción hidrofílica-espectrometría de masas (HILIC-MS) y la utilización de cuantificación dirigida, el uso riguroso de patrones internos y controles de fondo (Figura 1). Este protocolo tiene el potencial de preservar en gran medida las diferencias entre los tipos celulares y entre el tratamiento farmacológico y el control vehicular12. Incluso en el caso de las células cultivadas, se compara favorablemente con los enfoques alternativos, como la centrifugación más establecida y la eliminación manual del sobrenadante. Sin embargo, dado que aún pueden producirse artefactos de ordenación, los datos deben interpretarse con precaución. A pesar de esta limitación, el protocolo representa una mejora significativa en el campo de los perfiles metabólicos, permitiendo mediciones más precisas y completas del metabolismo celular en células primarias raras12.

La capacidad de medir de forma robusta amplios perfiles metabólicos en células primarias raras abre la puerta a nuevos experimentos en la investigación biomédica que involucran estas células. Por ejemplo, se ha demostrado que la regulación metabólicamente mediada en las HSC tiene un impacto en la capacidad de autorrenovación de la latencia, con implicaciones para la anemia y la leucemia11,17. En las células tumorales circulantes derivadas de pacientes, se han demostrado diferencias en la expresión de genes metabólicos entre el tumor y las células adyacentes18,19. Este protocolo permite ahora a los investigadores estudiar estas diferencias de forma sistemática a nivel metabólico, que generalmente se considera más cercano al fenotipo celular que a la expresión génica.

Protocol

La cría y la cría de todos los ratones utilizados para este protocolo se llevaron a cabo en una instalación de animales convencionales en el Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética (MPI-IE) de acuerdo con las regulaciones de las autoridades locales (Regierungspräsidium Freiburg). Los ratones fueron sacrificados con CO2 y luxación cervical por personal capacitado en FELASA B siguiendo las directrices y regulaciones aprobadas por el comité de bienestar animal del MPI-IE y las autoridades loc…

Representative Results

La clasificación FACS permite aislar poblaciones limpias de diferentes tipos celulares a partir de la misma suspensión celular (Figura 2 y Figura 3). La especificidad de este método se basa en la tinción de los diferentes tipos de células con marcadores de superficie específicos (por ejemplo, células B y células T del bazo) o combinaciones específicas de marcadores de superficie (por ejemplo, HSC y MPP). La tinción de marcadores intracelulares suele re…

Discussion

Los pasos más críticos para la implementación exitosa de la metabolómica dirigida utilizando este protocolo son: 1) una estrategia robusta de tinción y compuerta que produzca poblaciones celulares limpias, 2) el manejo preciso de los volúmenes líquidos, 3) el tiempo reproducible de todos los pasos experimentales, en particular todos los pasos previos a la extracción del metabolito. Idealmente, todas las muestras que pertenecen a un experimento deben procesarse y medirse en un lote para minimizar los efectos del l…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a la instalación de animales del Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética por proporcionar los animales utilizados en este estudio.

Materials

13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

Referanslar

  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

View Video