Özet

희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

Published: February 23, 2024
doi:

Özet

여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.

Abstract

세포 기능은 신진대사에 결정적으로 의존하며, 저분자 중간체를 측정하여 기본 대사 네트워크의 기능을 연구할 수 있습니다. 그러나 특히 조혈모세포와 같은 희귀 세포 유형에서 세포 대사를 정확하고 신뢰할 수 있는 측정값으로 얻으려면 전통적으로 여러 동물의 세포를 통합해야 했습니다. 이제 프로토콜에 따라 연구자들은 샘플당 하나의 마우스만 사용하여 희귀 세포 유형의 대사 산물을 측정하는 동시에 더 풍부한 세포 유형에 대한 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이렇게 하면 지정된 프로젝트에 필요한 동물의 수가 줄어듭니다. 여기에 제시된 프로토콜은 5g/L NaCl을 외피 유체로 사용하고, 아세토니트릴로 직접 분류하고, 내부 표준물질을 엄격하게 사용하여 표적 정량을 활용하는 등 기존 대사체학 프로토콜에 비해 몇 가지 주요 차이점을 포함하고 있어 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있습니다. 단일 세포의 분리, 형광 염색 및 분류에 필요한 시간에도 불구하고 프로토콜은 세포 유형 및 약물 처리 간의 차이를 상당 부분 보존할 수 있습니다.

Introduction

신진대사는 모든 살아있는 세포에서 발생하는 필수적인 생물학적 과정입니다. 대사 과정에는 밀접하게 조절되고 상호 연결된 방대한 생화학 반응 네트워크가 포함되며, 이를 통해 세포는 에너지를 생산하고 필수 생체 분자를 합성할 수 있습니다1. 대사 네트워크의 기능을 이해하기 위해 연구자들은 세포 내 저분자 중간체의 수준을 측정합니다. 이러한 중간체는 대사 활동의 중요한 지표 역할을 하며 세포 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

질량분석법(MS)은 복잡한 시료 1,2에서 대사 산물의 특이적 검출을 위해 가장 널리 사용되는 선택입니다. 핵 자기 공명(NMR)은 화합물의 절대 정량화 및 구조 규명에 장점이 있지만, MS는 종종 생체 유체 또는 세포 추출물과 같은 복잡한 혼합물에서 더 많은 성분을 분해할 수 있습니다. MS는 모세관 전기영동(CE), 가스 크로마토그래피(GC) 또는 액체 크로마토그래피(LC)에 의한 화합물의 사전 분리와 결합되는 경우가 많습니다3. 분리 플랫폼의 선택은 대부분 표적 대사 산물의 범위와 시료 유형에 따라 결정되며, 실제 환경에서는 기계 및 전문 지식의 가용성에 따라 결정됩니다. 세 가지 분리 플랫폼 모두 광범위하고 겹치는 범위의 적합한 대사 산물을 가지고 있지만 한계는 다릅니다. 간단히 말해서, CE는 하전 분자만 분리할 수 있으며 많은 수의 샘플에 대한 강력한 분석을 구현하려면 많은 전문 지식이 필요합니다4. GC는 분해되기 전에 증발할 수 있을 만큼 작고 무극성인 분자로 제한됩니다3. 상업적으로 이용 가능한 모든 LC 컬럼을 고려할 때, 임의의 두 대사 산물은 이 기술로 분리될 수 있다5. 그러나 많은 LC 분석법은 길이가 비슷한 CE 또는 GC 분석법보다 분해능이 떨어집니다.

대사체학 측정을 위한 출발 물질의 일반적인 양은 일반적으로 샘플당 5 x 105 내지 5 x 107 세포, 5-50 mg의 습윤 조직 또는 5-50 μL의 체액6 범위이다. 그러나 조혈모세포(HSC) 또는 순환 종양 세포와 같은 희귀 세포 유형의 일차 세포를 다룰 때 이러한 양의 시작 물질을 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 이러한 세포는 종종 매우 적은 수로 존재하며 중요한 세포 기능을 손상시키지 않고는 배양할 수 없습니다.

HSC와 다분화능 전구세포(MPP)는 조혈계에서 가장 분화가 적은 세포이며 유기체의 일생 동안 지속적으로 새로운 혈액 세포를 생성합니다. 조혈의 조절은 백혈병 및 빈혈과 같은 상태에서 임상적으로 관련이 있습니다. 그 중요성에도 불구하고 HSC와 MPP는 조혈계 내에서 가장 희귀한 세포 중 하나입니다. 단일 마우스에서 일반적으로 약 5000개의 HSC를 분리할 수 있습니다 7,8,9. 전통적인 대사체학 방법은 더 많은 투입 물질을 필요로 하기 때문에 희귀 세포 유형을 분석하기 위해 여러 마우스의 세포를 풀링하는 것이 종종 필요했습니다10,11.

여기에서, 우리는 단일 마우스(12)의 HSC로부터 대사체학 데이터를 생성할 수 있도록 샘플당 5000개 세포만큼 작은 세포에서 대사체의 측정을 가능하게 하는 프로토콜을 개발하는 것을 목표로 하였다. 동시에 이 방법을 사용하면 림프구와 같은 더 풍부한 세포 유형에 대해 단일 마우스에서 여러 복제를 생성할 수 있습니다. 이 접근 방식은 주어진 프로젝트에 필요한 동물의 수를 줄여 동물 실험의 “3R”(축소, 대체, 개선)에 기여합니다.

세포의 대사 산물은 종종 초13 정도로 매우 높은 회전율을 가질 수 있습니다. 그러나 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 시료 준비는 몇 시간이 걸릴 수 있으며, FACS 분류 자체는 몇 분에서 몇 시간이 걸릴 수 있으므로 비생리학적 조건으로 인해 대사체에 잠재적인 변화가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 일부 시약(예: 암모늄-클로라이드-칼륨[ACK] 용해 완충액)은 유사한 효과를 가질 수 있습니다. 이러한 조건은 세포 스트레스를 유발하고 세포 내 대사 산물의 수준과 비율에 영향을 미쳐 세포 대사의 부정확하거나 편향된 측정으로 이어질 수 있습니다 14,15,16. 시료 전처리로 인한 대사 변화는 때때로 분류 아티팩트(sorting artifact)라고 합니다. 단단하거나 질긴 조직에서 단세포 현탁액을 생성하는 데 필요할 수 있는 긴 분해 프로토콜과 가혹한 시약은 이 문제를 악화시킬 수 있습니다. 발생할 수 있는 변화는 셀 유형 및 처리 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 변화의 정확한 성질은 살아있는 조직에서 방해받지 않은 세포의 대사 상태를 측정할 수 없기 때문에 알려지지 않았습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 기존 방법과 비교하여 몇 가지 주요 차이점, 즉 5g/L NaCl을 피복 유체로 사용, 추출 완충액으로 직접 분류, 친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피-질량분석법(HILIC-MS)에 대량의 시료 주입, 표적 정량 활용, 내부 표준물질 및 백그라운드 제어의 엄격한 사용(그림 1)). 이 프로토콜은 세포 유형 간, 그리고 약물 처리와 차량 제어 사이의 차이를 상당 부분 보존할 수 있는 잠재력을 가지고 있다12. 배양된 세포의 경우에도 보다 확립된 원심분리 및 상층액의 수동 제거와 같은 대체 접근 방식과 유리하게 비교됩니다. 그러나 정렬 아티팩트가 계속 발생할 수 있으므로 데이터를 주의해서 해석해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 프로토콜은 대사 프로파일링 분야에서 상당한 개선을 나타내며, 희귀 일차 세포에서 세포 대사를 보다 정확하고 포괄적으로 측정할 수 있게 한다12.

희귀 일차 세포에서 광범위한 대사 프로파일을 강력하게 측정할 수 있는 능력은 이러한 세포와 관련된 생물 의학 연구의 새로운 실험의 문을 열어줍니다. 예를 들어, HSC의 대사 매개 조절은 빈혈 및 백혈병에 대한 영향과 함께 휴면 자가 재생 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다11,17. 환자 유래 순환 종양 세포에서 종양과 인접 세포 간의 대사 유전자 발현의 차이가18,19로 나타났습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 일반적으로 유전자 발현보다 세포 표현형에 더 가까운 것으로 간주되는 대사 수준에서 이러한 차이를 체계적으로 연구할 수 있습니다.

Protocol

이 프로토콜에 사용된 모든 마우스의 번식 및 사육은 지역 당국(Regierungspräsidium Freiburg)의 규정에 따라 막스 플랑크 면역생물학 및 후성유전학 연구소(MPI-IE)의 기존 동물 시설에서 수행되었습니다. 마우스는 MPI-IE의 동물 복지 위원회와 지역 당국이 승인한 지침 및 규정에 따라 FELASA B 교육을 받은 직원에 의해 CO2 및 자궁 경부 탈구로 안락사되었습니다. 동물 실험은 실시되지 않았으며, 생?…

Representative Results

FACS 분류를 통해 동일한 세포 현탁액에서 서로 다른 세포 유형의 깨끗한 집단을 분리할 수 있습니다(그림 2 및 그림 3). 이 방법의 특이성은 특정 표면 마커(예: 비장의 B 세포 및 T 세포) 또는 표면 마커의 특정 조합(예: HSC 및 MPP)을 사용한 다양한 세포 유형의 염색에 따라 달라집니다. 세포 내 마커의 염색에는 일반적으로 세포막의 투과화가 필요합니다. …

Discussion

이 프로토콜을 사용하여 표적 대사체학을 성공적으로 구현하기 위한 가장 중요한 단계는 1) 깨끗한 세포 집단을 산출하는 강력한 염색 및 게이팅 전략, 2) 액체 부피의 정확한 처리, 3) 모든 실험 단계, 특히 대사체 추출 전 모든 단계의 재현 가능한 타이밍입니다. 이상적으로는, 하나의 실험에 속하는 모든 샘플은 배치 효과를 최소화하기 위해 하나의 배치로 처리되고 측정되어야 한다

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 이 연구에 사용된 동물을 제공한 막스 플랑크 면역생물학 및 후성유전학 연구소(Max Planck Institute of Immunobiology and Epigenetics)의 동물 시설에 감사의 뜻을 전합니다.

Materials

13C yeast extract Isotopic Solutions ISO-1
40 µm cell strainer Corning 352340
Acetonitrile, LC-MS grade VWR 83640.32
ACK lysis buffer Gibco 104921 Alternatively: Lonza, Cat# BP10-548E
Adenosine diphosphate (ADP) Sigma Aldrich A2754
Adenosine monophosphate (AMP) Sigma Aldrich A1752
Adenosine triphosphate (ATP) Sigma Aldrich A2383
Ammonium Carbonate, HPLC grade Fisher Scientific A/3686/50
Atlantis Premier BEH Z-HILIC column (100 x 2.1 mm, 1.7 µm) Waters 186009982
B220-A647 Invitrogen 103226
B220-PE/Cy7 BioLegend 103222 RRID:AB_313005
CD11b-PE/Cy7 BioLegend 101216 RRID:AB_312799
CD150-BV605 BioLegend 115927 RRID:AB_11204248
CD3-PE Invitrogen 12-0031-83
CD48-BV421 BioLegend 103428 RRID:AB_2650894
CD4-PE/Cy7 BioLegend 100422 RRID:AB_2660860
CD8a-PE/Cy7 BioLegend 100722 RRID:AB_312761
cKit-PE BioLegend 105808 RRID:AB_313217
Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells Kit  Invitrogen 11415D
FACSAria III BD
Gr1-PE/Cy7 BioLegend 108416 RRID:AB_313381
Heat sealing foil Neolab Jul-18
Isoleucine Sigma Aldrich 58880
JetStream ESI Source Agilent G1958B
Leucine Sigma Aldrich L8000
Medronic acid Sigma Aldrich M9508-1G
Methanol, LC-MS grade Carl Roth HN41.2
NaCl Fluka 31434-1KG
PBS Sigma Aldrich D8537
Sca1-APC/Cy7 BioLegend 108126 RRID:AB_10645327
TER119-PE/Cy7 BioLegend 116221 RRID:AB_2137789
Triple Quadrupole Mass Spectrometer Agilent 6495B
Twin.tec PCR plate 96 well LoBind skirted Eppendorf 30129512
UHPLC Autosampler Agilent G7157B
UHPLC Column Thermostat Agilent G7116B
UHPLC Pump Agilent G7120A
UHPLC Sample Thermostat Agilent G4761A

Referanslar

  1. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and isotope tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  2. Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  3. Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism. Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).
  4. Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. Advances in capillary electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).
  5. Žuvela, P., et al. Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography. Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).
  6. Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc Available from: https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf (2023)
  7. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -. Y., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).
  8. Cabezas-Wallscheid, N., et al. Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis. Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).
  9. Belmonte, M., Kent, D. G. Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division. STAR Protocols. 2 (4), 100927 (2021).
  10. Devilbiss, A. W., et al. Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues. eLife. 10, 61980 (2021).
  11. Schönberger, K., et al. Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity. Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).
  12. Schönberger, K., et al. LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells. Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).
  13. Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo. Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).
  14. Binek, A., et al. Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome. Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).
  15. Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).
  16. Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox biology. 16, 381-387 (2018).
  17. Zhang, Y. W., et al. Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells. Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).
  18. Zafeiriadou, A., et al. Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer. Cancers. 14 (13), 3237 (2022).
  19. Chen, J., et al. Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59 (2020).
  20. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  21. Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning. Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).
  22. Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
  23. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  24. Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells. Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).
  25. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. 41, 1546 (2010).
  26. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).

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Glaser, K. M., Egg, M., Hobitz, S., Mitterer, M., Schain-Zota, D., Schönberger, K., Schuldes, K., Cabezas-Wallscheid, N., Lämmermann, T., Rambold, A., Buescher, J. M. Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells. J. Vis. Exp. (204), e65690, doi:10.3791/65690 (2024).

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