La funzione del muscolo scheletrico può essere valutata quantificando la contrattilità delle fibre muscolari isolate, tradizionalmente utilizzando approcci laboriosi e a basso rendimento. Qui, descriviamo un metodo basato sull’ottica e ad alto rendimento per quantificare la contrattilità delle fibre muscolari incorporate nell’idrogel. Questo approccio ha applicazioni per lo screening dei farmaci e lo sviluppo terapeutico.
La coltura cellulare in vitro è un potente strumento per valutare i processi cellulari e testare strategie terapeutiche. Per il muscolo scheletrico, gli approcci più comuni prevedono la differenziazione delle cellule progenitrici miogeniche in miotubi immaturi o la coltura ex vivo a breve termine di singole fibre muscolari isolate. Un vantaggio chiave della coltura ex vivo rispetto a quella in vitro è il mantenimento della complessa architettura cellulare e delle caratteristiche contrattili. Qui, dettagliamo un protocollo sperimentale per l’isolamento di fibre muscolari flessori digitorum brevis intatte dai topi e la loro successiva coltura ex vivo. In questo protocollo, le fibre muscolari sono incorporate in un idrogel a matrice di membrana a base di fibrina e basale per immobilizzare le fibre e mantenere la loro funzione contrattile. Descriviamo quindi i metodi per valutare la funzione contrattile delle fibre muscolari utilizzando un sistema di contrattilità basato sull’ottica e ad alto rendimento. Le fibre muscolari incorporate sono stimolate elettricamente per indurre contrazioni, dopo di che le loro proprietà funzionali, come l’accorciamento del sarcomero e la velocità contrattile, vengono valutate utilizzando la quantificazione basata sull’ottica. L’accoppiamento della coltura di fibre muscolari con questo sistema consente di testare ad alta produttività gli effetti degli agenti farmacologici sulla funzione contrattile e studi ex vivo di disturbi muscolari genetici. Infine, questo protocollo può anche essere adattato per studiare i processi cellulari dinamici nelle fibre muscolari utilizzando la microscopia a cellule vive.
I progressi nelle tecniche di coltura cellulare in vitro hanno aperto nuove possibilità per studiare le capacità rigenerative dei tessuti, i meccanismi cellulari fisiopatologici e le successive strategie terapeutiche, il tutto utilizzando tessuti di mammifero in condizioni ben controllate 1,2,3. L’uso di sistemi di coltura in vitro è ben consolidato nel campo della ricerca muscolare 4,5. In generale, in vitro vengono utilizzati miotubi immaturi differenziati da cellule progenitrici miogeniche 2,6,7,8. Sebbene siano stati compiuti progressi nel protocollo di differenziazione per generare fibre muscolari più mature9, la loro immaturità limita ancora la traduzione dei risultati in un setting in vivo 1,10. Un problema centrale nel campo della biologia muscolare è l’incapacità dei miotubi differenziati in vitro di incarnare pienamente le complesse strutture intracellulari, i processi di segnalazione cellulare e le interazioni extracellulari osservate nel tessuto muscolare nativo e, soprattutto, ricapitolare le forze contrattili prodotte dalle fibre muscolari 1,2,10,11,12 . Inoltre, la contrazione non coordinata dei miotubi durante il processo di differenziazione spesso provoca il distacco spontaneo dai piatti di coltura, rendendo la valutazione contrattile dei miotubi differenziati in vitro impegnativa e limitata alla valutazione qualitativa o semi-quantitativa 8,11,12,13. Queste limitazioni spesso richiedono regolari esperimenti in vivo con animali, videodan particolare se la contrattilità muscolare è un risultato sperimentale primario1.
Un’alternativa alla coltura videodan miotubi differenziati in vitro è la coltura ex vivo di fibre muscolari mature isolate 1,14. Durante la coltura ex vivo, il tessuto muscolare maturo dal punto di vista dello sviluppo viene asportato dal corpo, seguito dall’isolamento unicellulare per la coltivazione in condizioni di laboratorio 1,14. Le fibre muscolari mature isolate mantengono le loro complesse strutture cellulari osservate all’interno del tessuto nativo14,15, e questo metodo apre la possibilità di interventi diretti, come la manipolazione genetica e lo screening farmacologico, in un ambiente di coltura ben definito e controllabile. Uno dei primi rapporti riguardanti l’isolamento delle fibre muscolari scheletriche e la coltura ex vivo risale al 1930; Tuttavia, la resa di fibre vitali da questo protocollo era bassa16. Con la continua ottimizzazione della procedura di isolamento e delle condizioni di coltura, è ora possibile un significativo miglioramento della quantità di fibre muscolari vitali e funzionali 14,15,17,18,19. Uno di questi miglioramenti nelle condizioni di coltura comporta il rivestimento di piatti di coltura con proteine della matrice extracellulare per promuovere l’aderenza delle fibre muscolari isolate sul piatto di coltura15,18,20. Di solito, viene utilizzato il rivestimento di laminina, poiché la laminina è uno degli elementi più abbondanti all’interno della matrice extracellulare dei muscoli20,21. L’ottimizzazione della procedura di isolamento combinata con il rivestimento delle piastre di coltura hanno permesso al campo di ricerca muscolare di mantenere isolate fibre muscolari vitali con architettura cellulare intatta e funzionalità contrattile in coltura per brevi periodi di tempo 1,15,18,22.
L’approccio più convenzionale utilizzato nel campo muscolare per misurare la forza e le capacità contrattili è quello di montare singole fibre muscolari tra un motore driver di lunghezza e un trasduttore di forza23,24. In generale, le fibre muscolari utilizzate per queste configurazioni motorizzate, vengono sezionate da tessuto congelato o fresco, seguito da permeabilizzazione o “scuoiatura”, che consente l’attivazione esterna del calcio, in cui vengono utilizzate concentrazioni variabili di calcio per indurre la contrazione delle fibre muscolari24. Mentre questo metodo è il gold standard per le misurazioni contrattili delle fibre muscolari, solo una singola fibra muscolare può essere misurata alla volta, rendendo questa tecnica una procedura laboriosa e dispendiosa in termini di tempo25. Inoltre, la procedura di isolamento e scuoiatura delle fibre muscolari sconvolge le varie strutture coinvolte nell’accoppiamento eccitazione-contrazione (cioè rilascio di calcio e successiva ricaptazione nel reticolo sarcoplasmatico), non consentendo quindi lo studio della cinetica di rilassamento e di eventuali malattie che potrebbero influenzare questo processo26,27. Un’alternativa alla preparazione delle fibre scuoiate è l’uso della dissezione meccanica per isolare le fibre muscolari intatte, dove le forze contrattili possono essere misurate in risposta all’attivazione elettrica28; Tuttavia, questo approccio è tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, con conseguenti misurazioni a bassa produttività. Infine, sia nelle preparazioni spellate che intatte, le cellule muscolari vengono completamente rimosse dall’ambiente extracellulare durante le misurazioni contrattili 24, rendendo impossibile l’indagine dell’effetto della composizione/rigidità della matrice extracellulare sulla contrazione delle fibre muscolari24. Di conseguenza, è necessario lo sviluppo di metodi alternativi per consentire misurazioni della contrattilità delle fibre muscolari isolate intatte in modo ad alto rendimento, ricreando al contempo la connessione tra fibre muscolari e matrice extracellulare.
Recentemente, è stato sviluppato un nuovo approccio basato sull’ottica per misurazioni della contrattilità delle fibre muscolari ad alto rendimento29. Questo sistema basato sull’ottica misura la periodicità dei sarcomeri per valutare la lunghezza del sarcomero durante la contrazione utilizzando l’imaging ad alta velocità. All’interno di questo sistema, le cellule rimangono in posizione nel piatto di coltura mentre l’ottica viene spostata, riducendo così al minimo il tempo necessario tra le misurazioni di più cellule29. Uno dei principali vantaggi dell’utilizzo di questo approccio basato sull’ottica ad alto rendimento è che consente di sviluppare condizioni di coltura simili a quelle del tessuto nativo. Un approccio utilizzato per imitare le condizioni native in vivo è l’incorporazione delle cellule negli idrogel30. Tipicamente, un idrogel è un materiale viscoelastico in grado di mantenere il suo volume e la sua forma, e gli idrogel hanno le proprietà di materiali sia solidi che liquidi31. La parte solida è costituita da catene polimeriche reticolate tra loro, creando una struttura che sembra simile a una rete30,31. Le proprietà del materiale degli idrogel possono essere sintonizzate per imitare la deposizione della matrice dei muscoli30,31. Pertanto, la combinazione di un sistema ottico ad alto rendimento con cellule incorporate negli idrogel apre nuove possibilità per valutare gli effetti della composizione della matrice extracellulare e delle proprietà meccaniche sulla funzionalità delle fibre muscolari.
L’obiettivo generale di questo articolo è quello di 1) descrivere la metodologia per l’isolamento enzimatico e la coltura ex vivo di fibre muscolari in condizioni che imitano l’ambiente tissutale nativo e 2) valutare la contrattilità delle fibre muscolari utilizzando un approccio ad alto rendimento. Descriviamo una metodologia dettagliata per isolare facilmente un gran numero di singole fibre muscolari dal muscolo flessore digitorum brevis (FDB) utilizzando la digestione enzimatica. Inoltre, descriviamo una tecnica per incorporare le fibre muscolari isolate in un idrogel a base di fibrina per imitare l’ambiente nativo dei muscoli e migliorare la vitalità e la contrattilità delle fibre muscolari. Descriviamo quindi un metodo ad alto rendimento per misurare le contrazioni delle fibre muscolari vive in vitro utilizzando questo sistema recentemente sviluppato. Un ulteriore vantaggio di questa procedura di incorporamento è l’immobilizzazione delle fibre durante la contrazione, che può migliorare il rapporto segnale-rumore di queste misurazioni. Questo metodo di incorporamento del gel è applicabile sia per le procedure di incapsulamento di singoli polimeri che di gel composito, facilitando la valutazione degli effetti della composizione della matrice extracellulare sulla contrattilità delle fibre muscolari.
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo per eseguire l’isolamento enzimatico e la coltura delle fibre muscolari FDB in un formato di coltura 3D, seguito da misurazioni contrattili utilizzando un sistema di misurazione contrattile basato su ottica. Questo protocollo ha una serie di vantaggi, tra cui il 1) isolamento diretto e tempestivo di molte fibre muscolari intatte da un singolo muscolo; 2) l’incorporazione delle fibre muscolari in una matrice idrogel sintonizzabile; 3) l’esecuzione di misure di contrattilità ad alta produttività utilizzando il sistema basato sull’ottica; e 4) la capacità di effettuare misurazioni ripetute delle stesse fibre muscolari a seguito di un intervento. L’isolamento di singole fibre muscolari vive fornisce cellule muscolari mature che mantengono la loro funzione contrattile. Poiché le fibre muscolari ottenute dal topo FDB sono relativamente piccole, sono facilmente manipolabili durante l’isolamento e mantengono la loro forma diritta, consentendo misurazioni contrattili a valle. Sebbene il sistema sia stato sviluppato principalmente per studiare la contrazione dei cardiomiociti, le fibre muscolari scheletriche contengono lo stesso meccanismo contrattile con pattern sarcomero facilmente distinguibile e, quindi, possono anche essere misurati utilizzando questo sistema29. L’accoppiamento di misurazioni contrattili a singola cellula con colture di fibre muscolari ex vivo è un potente strumento per valutare la salute e la funzione delle fibre muscolari mature in risposta all’attivazione elettrica.
Una limitazione dell’uso di fibre muscolari dissociate è la mancanza di forze esterne (cioè allungamento passivo) applicate alle fibre, che si traduce in lunghezze del sarcomero a riposo inferiori rispetto a quelle trovate in vivo. Sebbene una lunghezza del sarcomero di 2,4-2,5 μm garantisca una produzione ottimale di forza, la lunghezza del sarcomero a riposo può variare notevolmente33. Mentre la lunghezza del sarcomero a riposo in vivo dell’FDB non è stata ancora descritta, i nostri dati non pubblicati suggeriscono una lunghezza media di 2,2 μm. I risultati attuali mostrano una lunghezza media del sarcomero a riposo di ~ 1,95 μm nelle fibre FDB scaricate dopo 24 ore in coltura (Figura 3). Sebbene questa minore lunghezza del sarcomero a riposo comporterebbe una minore produzione di forza, una lunghezza di ~ 1,95 μm dovrebbe comunque produrre il >90% della forza massima34. Pertanto, queste lunghezze del sarcomero dovrebbero essere sufficienti a determinare le differenze nella funzione delle fibre tra diversi modelli genetici o dopo trattamenti farmacologici. Inoltre, l’incorporazione delle fibre in un idrogel fornisce molti punti aggiuntivi per l’adesione rispetto alle fibre coltivate 2D fluttuanti, che limiterebbero l’ulteriore accorciamento del sarcomero nel tempo.
Un vantaggio di questo protocollo di isolamento delle fibre muscolari è l’uso di un muscolo a contrazione rapida facilmente sezionato costituito da fibre muscolari relativamente piccole rispetto ad altri muscoli, come l’estensore digitorum longus (EDL). Le loro dimensioni ridotte rendono l’isolamento muscolare più adatto alla separazione basata sulla triturazione, riducendo così la possibilità di danni indotti da pipet o grovigli alle fibre muscolari. La matrice extracellulare dei muscoli FDB può essere facilmente digerita enzimaticamente con collagenasi, consentendo l’isolamento di centinaia di fibre muscolari in un breve periodo di tempo. Tuttavia, la sovradigestione può portare a danni alle fibre muscolari. La sovradigestione delle fibre muscolari può essere riconosciuta quando il muscolo cade a pezzi quasi istantaneamente durante la triturazione del muscolo o quando una grande percentuale del volume cellulare è ipercontratta durante la procedura di semina cellulare. Per prevenire la sovradigestione del muscolo, il tempo di digestione deve essere ottimizzato per ogni lotto di collagenasi. Per testare questo, due muscoli FDB dovrebbero essere digeriti in parallelo con un tempo di digestione scaglionato di 5 minuti tra di loro. Dovrebbe essere scelto il tempo di digestione con la più alta resa di fibre muscolari vitali. Questa ottimizzazione dovrebbe quindi essere eseguita una seconda volta, sempre con 5 minuti di separazione nel tempo di digestione. Il tempo di digestione che produce le fibre muscolari vitali più elevate dovrebbe essere utilizzato come tempo di digestione ottimale per l’attuale lotto di collagenasi. Un altro modo per limitare la variabilità da lotto a lotto della collagenasi sarebbe quello di calcolare direttamente le unità di attività per millilitro di soluzione madre e quindi ricostituire i successivi lotti di collagenasi alla stessa quantità. Infine, potrebbe essere necessario ottimizzare i tempi di digestione su diversi ceppi murini, ad esempio se si studiano animali anziani o malati che presentano un aumento della deposizione di matrice extracellulare35,36.
La possibilità di pipettare fibre muscolari isolate vitali apre possibilità alla coltura di fibre muscolari FDB in varie condizioni di coltura. Una di queste opzioni è la coltura di queste fibre in idrogel per imitare l’ambiente di coltura dei tessuti nativi. Questo protocollo di incorporamento assicura che le fibre rimangano in posizione durante le misurazioni contrattili ed è stato ottimizzato per consentire alle fibre di depositarsi sul fondo della piastra prima che il gel si stabilizzi. Tuttavia, potrebbe essere necessario adeguare questo protocollo per tener conto delle differenze nelle scorte di trombina e fibrinogeno. Se l’attività della trombina è troppo alta, il gel si fisserà prematuramente e le fibre potrebbero rimanere sospese in posizioni più alte al di fuori del piano focale del microscopio. Se ciò accade, il rapporto trombina:fibrinogeno deve essere regolato. Questo può essere testato placcando le fibre in concentrazioni di trombina sempre più basse e prendendo nota di quanto tempo richiede la polimerizzazione. In genere, questo non dovrebbe accadere più velocemente di 30 minuti. Tuttavia, avere una concentrazione di trombina troppo bassa può anche compromettere il processo di polimerizzazione. Un altro metodo per garantire che le fibre siano nel piano focale corretto è quello di seminarle prima utilizzando un protocollo 2D e quindi aggiungere uno strato di idrogel sulle fibre dopo che hanno aderito alla piastra di coltura. Tuttavia, si dovrebbe essere consapevoli che la rimozione del mezzo dalle fibre può indurre ipercontrazione, poiché sono sensibili all’essiccazione. Inoltre, non è chiaro se l’idrogel si attaccherà completamente alla piastra di coltura e potrebbe staccarsi più facilmente. Pertanto, questa procedura di incorporamento è preferibile per mantenere le fibre vitali e in posizione per le misurazioni della contrazione.
L’utilizzo di questo protocollo consente lo studio della dinamica contrattile delle fibre muscolari mature ex vivo e può essere applicato sia a topi sani che a quelli portatori di mutazioni genetiche per malattie muscolari. Allo stesso modo, consente di testare come le condizioni di coltura o l’aggiunta di composti influenzano la funzione delle fibre muscolari. I dati contrattili ottenuti utilizzando il sistema basato sull’ottica forniscono un’indicazione della capacità contrattile delle singole fibre muscolari vive e i cambiamenti in questa capacità possono essere correlati alla salute delle fibre. Questi dati da soli, tuttavia, non sono sufficienti per determinare se questi cambiamenti si verificano nelle fasi di ponte incrociato actina-miosina o di rilascio del calcio della contrazione muscolare. Sebbene non descriviamo i metodi per misurare la segnalazione del calcio in questo protocollo, questa configurazione è anche in grado di misurare i transitori di calcio a base di Frua nelle cellule muscolari contratte29. Uno svantaggio di questo sistema è che il muscolo FDB contiene solo fibre muscolari di tipo IIa/IIx a contrazione rapida e i muscoli contenenti fibre di tipo I a contrazione lenta di queste dimensioni non sono ancora stati descritti37. Ciò elimina la capacità di studiare il funzionamento specifico del tipo di fibra utilizzando questo metodo. Il protocollo che proponiamo qui potrebbe potenzialmente essere adattato per altri muscoli come l’EDL o il soleo per studiare le differenze di tipo di fibra. A causa delle loro dimensioni maggiori, questo protocollo dovrebbe essere ulteriormente ottimizzato per questi muscoli. Le fibre più lunghe tendono ad aggrovigliarsi durante la fase di sedimentazione gravitazionale e si rompono se manipolate mediante pipettaggio, il che porterebbe a una minore resa. A causa della loro incompatibilità con il pipettaggio, le fibre più lunghe sono, quindi, anche meno compatibili con la tecnica di incorporamento del gel. Le misurazioni di queste fibre possono ancora essere eseguite in un formato di coltura 2D, ma le fibre possono muoversi di più durante la contrazione a causa delle loro dimensioni, influenzando così il rapporto segnale-rumore. Un’altra limitazione di questo sistema è l’incapacità di eseguire misurazioni della forza accanto alle misurazioni contrattili, come quelle misurazioni della forza che possono essere ottenute utilizzando altri preparati di fibre muscolari intatte28. Tuttavia, questa limitazione può essere aggirata stimando la forza generata dalla fibra muscolare. La forza generata delle fibre muscolari può essere stimata se la forma della fibra muscolare durante gli stati contratti e rilassati e il modulo di Young della matrice sono noti25. Tuttavia, questo sistema basato sull’ottica fornisce un approccio facile da usare e ad alto rendimento per lo studio della funzione contrattile muscolare e apre una serie di nuove possibilità per lo studio delle malattie muscolari genetiche e degli interventi terapeutici.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes ed Emmy Manders per la loro competenza tecnica nello sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato da premi della Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 a T.J.K), della Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) e del National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australia; Fellowship APP1121651 a M.Y).
Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
Equipment | |||
24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
MyoPacer | IonOptix | N/a | |
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Software | |||
CytoSolver | IonOptix | N/a | |
IonWizard | IonOptix | N/a |