Hochdurchsatz-Kontraktionsmessungen von Hydrogel-eingebetteten intakten Muskelfasern der Maus mit einem optikbasierten System
Özet
Die Funktion der Skelettmuskulatur kann durch die Quantifizierung der Kontraktilität isolierter Muskelfasern beurteilt werden, wobei traditionell mühsame Ansätze mit niedrigem Durchsatz verwendet werden. Hier beschreiben wir eine optikbasierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung der Kontraktilität von Hydrogel-eingebetteten Muskelfasern. Dieser Ansatz hat Anwendungen für das Wirkstoffscreening und die therapeutische Entwicklung.
Abstract
Die In-vitro-Zellkultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um zelluläre Prozesse zu beurteilen und therapeutische Strategien zu testen. Für die Skelettmuskulatur sind die gebräuchlichsten Ansätze entweder die Differenzierung myogener Vorläuferzellen in unreife Myotuben oder die kurzfristige ex vivo Kultur isolierter einzelner Muskelfasern. Ein wesentlicher Vorteil der Ex-vivo-Kultur gegenüber der In-vitro-Kultur ist die Beibehaltung der komplexen zellulären Architektur und der kontraktilen Eigenschaften. In dieser Arbeit beschreiben wir ein experimentelles Protokoll für die Isolierung von intakten Muskelfasern des Flexor digitorum brevis aus Mäusen und deren anschließende ex vivo Kultur. Bei diesem Protokoll werden die Muskelfasern in ein Hydrogel auf Fibrinbasis und Basalmembranmatrix eingebettet, um die Fasern zu immobilisieren und ihre kontraktile Funktion aufrechtzuerhalten. Anschließend beschreiben wir Methoden zur Beurteilung der kontraktilen Funktion der Muskelfaser mit Hilfe eines optikbasierten Hochdurchsatz-Kontraktilitätssystems. Die eingebetteten Muskelfasern werden elektrisch stimuliert, um Kontraktionen zu induzieren, woraufhin ihre funktionellen Eigenschaften, wie Sarkomerverkürzung und Kontraktionsgeschwindigkeit, mit Hilfe einer optischen Quantifizierung bewertet werden. Die Kopplung der Muskelfaserkultur mit diesem System ermöglicht Hochdurchsatztests der Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe auf die kontraktile Funktion und Ex-vivo-Studien zu genetischen Muskelerkrankungen. Schließlich kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um dynamische zelluläre Prozesse in Muskelfasern mit Hilfe der Lebendzellmikroskopie zu untersuchen.
Introduction
Fortschritte in der In-vitro-Zellkulturtechnik haben neue Möglichkeiten eröffnet, die Regenerationsfähigkeit von Gewebe, pathophysiologische zelluläre Mechanismen und anschließende therapeutische Strategien zu untersuchen und dabei Säugetiergewebe unter gut kontrollierten Bedingungen zu verwenden 1,2,3. Der Einsatz von In-vitro-Kultursystemen ist in der Muskelforschung gut etabliert 4,5. Im Allgemeinen werden in vitro differenzierte unreife Myotuben aus myogenen Vorläuferzellen verwendet 2,6,7,8. Obwohl Fortschritte im Differenzierungsprotokoll erzielt wurden, um reifere Muskelfasern zu erzeugen9, schränkt ihre Unreife die Übertragung der Ergebnisse auf eine In-vivo-Umgebung immer noch ein 1,10. Ein zentrales Problem auf dem Gebiet der Muskelbiologie ist die Unfähigkeit von in vitro differenzierten Myotuben, die komplexen intrazellulären Strukturen, zellulären Signalprozesse und extrazellulären Interaktionen, die videodan nativem Muskelgewebe beobachtet werden, vollständig zu verkörpern und vor allem die von Muskelfasern erzeugten kontraktilen Kräfte zu rekapitulieren 1,2,10,11,12 . Darüber hinaus führt die unkoordinierte Kontraktion von Myotuben während des Differenzierungsprozesses häufig zu einer spontanen Ablösung von den Kulturschalen, was die kontraktile Beurteilung von in vitro differenzierten Myotuben schwierig macht und auf eine qualitative oder semiquantitativeBewertung beschränkt 8,11,12,13. Diese Einschränkungen erfordern häufig regelmäßige In-vivo-Experimente mit Tieren, insbesondere wenn die Muskelkontraktilität ein primäres Versuchsergebnis ist1.
Eine Alternative zur Kultivierung von in vitro differenzierten Myotuben ist die ex vivo Kultur isolierter reifer Muskelfasern 1,14. Bei der Ex-vivo-Kultur wird entwicklungsreifes Muskelgewebe aus dem Körper herausgeschnitten, gefolgt von einer Einzelzellisolierung zur Kultivierung unter Laborbedingungen 1,14. Die isolierten reifen Muskelfasern behalten ihre komplexen zellulären Strukturen bei, die im nativen Gewebe beobachtet werden14,15, und diese Methode eröffnet die Möglichkeit für direkte Eingriffe, wie z. B. genetische Manipulation und Drogenscreening, in einer genau definierten und kontrollierbaren Kulturumgebung. Einer der ersten Berichte über die Isolierung von Skelettmuskelfasern und die Ex-vivo-Kultur stammt aus den 1930er Jahren. Die Ausbeute an lebensfähigen Fasern aus diesem Protokoll war jedoch gering16. Mit der kontinuierlichen Optimierung des Isolationsverfahrens und der Kulturbedingungen ist nun eine signifikante Verbesserung der Menge an lebensfähigen und funktionellen Muskelfasern möglich 14,15,17,18,19. Eine solche Verbesserung der Kulturbedingungen besteht darin, Kulturschalen mit extrazellulären Matrixproteinen zu beschichten, um die Adhärenz der isolierten Muskelfasern auf der Kulturschale zu fördern15,18,20. In der Regel wird eine Lamininbeschichtung verwendet, da Laminin eines der am häufigsten vorkommenden Elemente in der extrazellulären Matrix der Muskeln ist20,21. Die Optimierung des Isolationsverfahrens in Kombination mit der Beschichtung der Kulturschalen hat es der Muskelforschung ermöglicht, isolierte lebensfähige Muskelfasern mit intakter zellulärer Architektur und kontraktiler Funktionalität für kurze Zeiträume in Kultur zu halten 1,15,18,22.
Der gebräuchlichste Ansatz, der im Muskelfeld zur Messung von Kraft und Kontraktionsfähigkeiten verwendet wird, besteht darin, einzelne Muskelfasern zwischen einem Längentreibermotor und einem Kraftaufnehmerzu montieren 23,24. Im Allgemeinen werden die Muskelfasern, die für diese motorgetriebenen Setups verwendet werden, entweder aus schockgefrorenem oder frischem Gewebe präpariert, gefolgt von einer Permeabilisierung oder “Enthäutung”, die eine externe Kalziumaktivierung ermöglicht, bei der unterschiedliche Kalziumkonzentrationen verwendet werden, um die Muskelfaserkontraktion zu induzieren24. Obwohl diese Methode der Goldstandard für kontraktile Messungen von Muskelfasern ist, kann jeweils nur eine einzelne Muskelfaser gemessen werden, was diese Technik zu einem mühsamen und zeitaufwändigen Verfahren macht25. Darüber hinaus stört das Isolations- und Enthäutungsverfahren der Muskelfasern die verschiedenen Strukturen, die an der Kopplung von Erregung und Kontraktion beteiligt sind (d. h. die Freisetzung von Kalzium und die anschließende Wiederaufnahme in das sarkoplasmatische Retikulum), wodurch die Untersuchung der Relaxationskinetik und aller Krankheiten, die diesen Prozess beeinflussen könnten, nicht möglich ist26,27. Eine Alternative zur Präparation von Skinnfasern ist die mechanische Dissektion zur Isolierung intakter Muskelfasern, bei denen kontraktile Kräfte als Reaktion auf die elektrische Aktivierung gemessen werden können28; Dieser Ansatz ist jedoch technisch anspruchsvoll und sehr zeitaufwändig, was zu Messungen mit geringem Durchsatz führt. Schließlich werden sowohl bei gehäuteten als auch bei intakten Präparaten die Muskelzellen während kontraktiler Messungen 24 vollständig aus der extrazellulären Umgebung entfernt, was die Untersuchung des Einflusses der Zusammensetzung/Steifigkeit der extrazellulären Matrix auf die Muskelfaserkontraktion24 unmöglich macht. Daher ist die Entwicklung alternativer Methoden erforderlich, um Messungen der Muskelfaserkontraktilität isolierter intakter Muskelfasern in einem Hochdurchsatz zu ermöglichen und gleichzeitig die Verbindung zwischen Muskelfasern und der extrazellulären Matrix wiederherzustellen.
Kürzlich wurde ein neuer optikbasierter Ansatz für Hochdurchsatzmessungen der Muskelfaserkontraktilität entwickelt29. Dieses auf Optik basierende System misst die Periodizität von Sarkomen, um die Sarkomerlänge während der Kontraktion mit Hilfe von Hochgeschwindigkeitsbildgebung zu bestimmen. Innerhalb dieses Systems bleiben die Zellen in der Kulturschale an Ort und Stelle, während die Optik bewegt wird, wodurch die Zeit, die zwischen den Messungen mehrerer Zellen29 benötigt wird, minimiert wird. Ein großer Vorteil dieses optischen Hochdurchsatzansatzes besteht darin, dass er die Entwicklung von Kulturbedingungen ermöglicht, die denen des nativen Gewebes ähneln. Ein Ansatz, der zur Nachahmung nativer In-vivo-Bedingungen verwendet wird, ist die Einbettung von Zellen in Hydrogele30. Typischerweise ist ein Hydrogel ein viskoelastisches Material, das in der Lage ist, sein Volumen und seine Form beizubehalten, und Hydrogele haben die Eigenschaften sowohl fester als auch flüssiger Materialien31. Der feste Teil besteht aus miteinander vernetzten Polymerketten, wodurch eine Struktur entsteht, die einem Netzähnelt 30,31. Die Materialeigenschaften von Hydrogelen können so eingestellt werden, dass sie die Matrixablagerung von Muskeln nachahmen30,31. Die Kombination eines optischen Hochdurchsatzsystems mit in Hydrogelen eingebetteten Zellen eröffnet somit neue Möglichkeiten, die Auswirkungen der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix und der mechanischen Eigenschaften auf die Funktionalität der Muskelfaser zu bewerten.
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, 1) die Methodik für die enzymatische Isolierung und Ex-vivo-Kultur von Muskelfasern unter Bedingungen, die die native Gewebeumgebung nachahmen, zu beschreiben und 2) die Kontraktilität der Muskelfasern unter Verwendung eines Hochdurchsatzansatzes zu bewerten. Wir beschreiben eine detaillierte Methodik zur einfachen Isolierung einer großen Anzahl einzelner Muskelfasern aus dem Musculus flexor digitorum brevis (FDB) mittels enzymatischer Verdauung. Darüber hinaus beschreiben wir eine Technik, bei der die isolierten Muskelfasern in ein Hydrogel auf Fibrinbasis eingebettet werden, um die natürliche Umgebung der Muskeln nachzuahmen und die Lebensfähigkeit und Kontraktilität der Muskelfasern zu verbessern. Anschließend skizzieren wir eine Hochdurchsatzmethode zur Messung lebender Muskelfaserkontraktionen in vitro mit diesem kürzlich entwickelten System. Ein weiterer Vorteil dieses Einbettungsverfahrens ist die Immobilisierung der Fasern während der Kontraktion, was das Signal-Rausch-Verhältnis dieser Messungen verbessern kann. Diese Geleinbettungsmethode ist sowohl für Einzelpolymer- als auch für Kompositgelverkapselungsverfahren anwendbar und erleichtert die Beurteilung der Auswirkungen der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix auf die Kontraktilität der Muskelfasern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der enzymatischen Isolierung und Kultivierung von FDB-Muskelfasern in einem 3D-Kulturformat, gefolgt von kontraktilen Messungen mit einem optikbasierten kontraktilen Messsystem. Dieses Protokoll hat eine Reihe von Vorteilen, darunter 1) die einfache und rechtzeitige Isolierung vieler intakter Muskelfasern von einem einzigen Muskel; 2) die Einbettung der Muskelfasern in eine einstellbare Hydrogelmatrix; 3) die Durchführung von Hochdurchsatz-Kontraktilitätsmessungen unter Verwendung des optikbasierten Systems; und 4) die Fähigkeit, nach einem Eingriff wiederholte Messungen derselben Muskelfasern durchzuführen. Die Isolierung einzelner lebender Muskelfasern sorgt für reife Muskelzellen, die ihre kontraktile Funktion behalten. Da die Muskelfasern, die aus dem FDB der Maus gewonnen werden, relativ klein sind, können sie während der Isolation leicht manipuliert werden und behalten ihre gerade Form bei, was nachgeschaltete kontraktile Messungen ermöglicht. Obwohl das System in erster Linie entwickelt wurde, um die Kontraktion von Kardiomyozyten zu untersuchen, enthalten die Skelettmuskelfasern die gleiche kontraktile Maschinerie mit leicht unterscheidbaren Sarkomermustern und können daher auch mit diesem System gemessen werden29. Die Kopplung von Einzelzell-Kontraktilmessungen mit lebenden ex vivo Muskelfaserkulturen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Beurteilung der Gesundheit und Funktion reifer Muskelfasern als Reaktion auf elektrische Aktivierung.
Eine Einschränkung bei der Verwendung dissoziierter Muskelfasern ist das Fehlen externer Kräfte (d. h. passive Dehnung), die auf die Fasern ausgeübt werden, was zu geringeren Ruhesarkomerlängen im Vergleich zu denen führt, die in vivo gefunden wurden. Obwohl eine Sarkomerlänge von 2,4-2,5 μm für eine optimale Krafterzeugung sorgt, kann die Ruhesarkomerlänge stark variieren33. Während die in vivo Ruhesarkomerlänge des FDB noch nicht beschrieben wurde, deuten unsere eigenen unveröffentlichten Daten auf eine durchschnittliche Länge von 2,2 μm hin. Die aktuellen Ergebnisse zeigen eine durchschnittliche Ruhesarkomerlänge von ~1,95 μm in unbelasteten FDB-Fasern nach 24 h in Kultur (Abbildung 3). Obwohl diese geringere Ruhesarkomerlänge zu einer geringeren Krafterzeugung führen würde, sollte eine Länge von ~1,95 μm immer noch >90% der maximalen Krafterzeugen 34. Daher sollten diese Sarkomerlängen ausreichen, um Unterschiede in der Faserfunktion zwischen verschiedenen genetischen Modellen oder nach medikamentösen Behandlungen zu bestimmen. Darüber hinaus bietet die Einbettung von Fasern in ein Hydrogel im Vergleich zu frei schwebenden 2D-kultivierten Fasern viele zusätzliche Adhäsionspunkte, was eine weitere Sarkomerverkürzung im Laufe der Zeit begrenzen würde.
Ein Vorteil dieses Protokolls zur Isolierung von Muskelfasern ist die Verwendung eines leicht zu präparierenden, schnell zuckenden Muskels, der im Vergleich zu anderen Muskeln, wie z. B. dem Extensor digitorum longus (EDL), aus relativ kleinen Muskelfasern besteht. Aufgrund ihrer geringeren Größe eignet sich die Muskelisolierung besser für die Verreibungstrennung, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer durch Pipetten oder Verwicklungen verursachten Schädigung der Muskelfasern verringert wird. Die extrazelluläre Matrix der FDB-Muskeln kann leicht enzymatisch mit Kollagenase verdaut werden, was die Isolierung von Hunderten von Muskelfasern in kurzer Zeit ermöglicht. Eine Überverdauung kann jedoch zu einer Schädigung der Muskelfasern führen. Die Überverdauung der Muskelfasern ist daran zu erkennen, dass der Muskel beim Verreiben des Muskels fast augenblicklich auseinanderfällt oder wenn ein großer Teil des Zellvolumens während der Zellaussaat überkontrahiert wird. Um eine Überverdauung des Muskels zu verhindern, muss die Verdauungszeit für jede Kollagenase-Charge optimiert werden. Um dies zu testen, sollten zwei FDB-Muskeln parallel mit einer gestaffelten Verdauungszeit von 5 min dazwischen verdaut werden. Es sollte die Verdauungszeit mit der höchsten Ausbeute an lebensfähigen Muskelfasern gewählt werden. Diese Optimierung sollte dann ein zweites Mal durchgeführt werden, wieder mit einer Trennung von 5 Minuten in der Aufschlusszeit. Die Verdauungszeit, die die höchsten lebensfähigen Muskelfasern liefert, sollte als optimale Verdauungszeit für die aktuelle Kollagenase-Charge verwendet werden. Eine andere Möglichkeit, die Variabilität der Kollagenase von Charge zu Charge zu begrenzen, besteht darin, die Aktivitätseinheiten pro Milliliter Stammlösung direkt zu berechnen und dann die nachfolgenden Kollagenase-Chargen auf die gleiche Menge zu rekonstruieren. Schließlich müssen die Verdauungszeiten möglicherweise über verschiedene Mausstämme hinweg optimiert werden, z. B. bei der Untersuchung älterer oder erkrankter Tiere, die eine erhöhte Ablagerung der extrazellulären Matrix aufweisen35,36.
Die Möglichkeit, lebensfähige isolierte Muskelfasern zu pipettieren, eröffnet die Möglichkeit, FDB-Muskelfasern unter verschiedenen Kulturbedingungen zu kultivieren. Eine solche Option ist die Kultivierung dieser Fasern in Hydrogelen, um die native Gewebekulturumgebung nachzuahmen. Dieses Einbettungsprotokoll stellt sicher, dass die Fasern während der kontraktilen Messungen an Ort und Stelle bleiben, und wurde so optimiert, dass sich die Fasern am Boden der Platte absetzen können, bevor das Gel aushärtet. Dieses Protokoll muss jedoch möglicherweise angepasst werden, um den Unterschieden in den Thrombin- und Fibrinogenvorräten Rechnung zu tragen. Wenn die Thrombinaktivität zu hoch ist, wird das Gel vorzeitig aushärten, und die Fasern können an höheren Stellen außerhalb der Brennebene des Mikroskops in der Schwebe bleiben. In diesem Fall muss das Verhältnis von Thrombin zu Fibrinogen angepasst werden. Dies kann getestet werden, indem Fasern in immer niedrigeren Thrombinkonzentrationen plattiert werden und darauf geachtet wird, wie lange die Polymerisation dauert. In der Regel sollte dies nicht schneller als 30 Minuten geschehen. Eine zu niedrige Thrombinkonzentration kann jedoch auch den Polymerisationsprozess beeinträchtigen. Eine andere Methode, um sicherzustellen, dass sich die Fasern in der richtigen Fokusebene befinden, besteht darin, sie zuerst mit einem 2D-Protokoll zu säen und dann eine Schicht Hydrogel über die Fasern zu legen, nachdem sie an der Kulturplatte haften. Man sollte sich jedoch darüber im Klaren sein, dass das Entfernen des Mediums aus den Fasern zu einer Hyperkontraktion führen kann, da diese empfindlich auf Austrocknung reagieren. Es ist auch unklar, ob sich das Hydrogel vollständig an der Kulturplatte festsetzt und sich leichter lösen kann. Daher ist dieses Einbettungsverfahren vorzuziehen, um Fasern lebensfähig und für Kontraktionsmessungen an Ort und Stelle zu halten.
Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die Untersuchung der kontraktilen Dynamik reifer Muskelfasern ex vivo und kann sowohl auf gesunde Mäuse als auch auf Mäuse angewendet werden, die genetische Mutationen für Muskelerkrankungen tragen. Ebenso ermöglicht es zu testen, wie sich die Kulturbedingungen oder die Zugabe von Verbindungen auf die Funktion der Muskelfasern auswirken. Die mit dem optischen System gewonnenen kontraktilen Daten geben einen Hinweis auf die Kontraktionsfähigkeit lebender einzelner Muskelfasern, und Veränderungen dieser Fähigkeit können mit der Fasergesundheit korreliert werden. Diese Daten allein reichen jedoch nicht aus, um festzustellen, ob diese Veränderungen in den Phasen der Aktin-Myosin-Kreuzüberbrückung oder der Kalziumfreisetzung der Muskelkontraktion auftreten. Obwohl wir in diesem Protokoll keine Methoden zur Messung der Calcium-Signalübertragung beschreiben, ist dieser Aufbau auch in der Lage, Fura-basierte Calcium-Transienten in kontrahierenden Muskelzellen zu messen29. Ein Nachteil dieses Systems besteht darin, dass der FDB-Muskel nur schnell zuckende Typ-IIa/IIx-Muskelfasern enthält, und Muskeln, die langsam zuckende Typ-I-Fasern dieser Größe enthalten, wurden noch nicht beschrieben37. Dadurch entfällt die Möglichkeit, die fasertypspezifische Funktion mit dieser Methode zu untersuchen. Das Protokoll, das wir hier vorschlagen, könnte möglicherweise für andere Muskeln wie den EDL oder den Soleus angepasst werden, um Unterschiede im Fasertyp zu untersuchen. Aufgrund ihrer größeren Größe müsste dieses Protokoll für diese Muskeln weiter optimiert werden. Längere Fasern neigen dazu, sich während der Schwerkraftsedimentation zu verheddern und zu reißen, wenn sie durch Pipettieren manipuliert werden, was zu einer geringeren Ausbeute führen würde. Aufgrund ihrer Unverträglichkeit mit dem Pipettieren sind längere Fasern daher auch weniger kompatibel mit der Gel-Embedding-Technik. Messungen dieser Fasern können immer noch in einem 2D-Kulturformat durchgeführt werden, aber die Fasern können sich aufgrund ihrer Größe während der Kontraktion stärker bewegen, was das Signal-Rausch-Verhältnis beeinflusst. Eine weitere Einschränkung dieses Systems ist die Unfähigkeit, Kraftmessungen neben den kontraktilen Messungen durchzuführen, wie z. B. Kraftmessungen, die mit anderen intakten Muskelfaserpräparaten erzielt werden können28. Diese Einschränkung kann jedoch umgangen werden, indem die von der Muskelfaser erzeugte Kraft geschätzt wird. Die erzeugte Kraft der Muskelfasern kann abgeschätzt werden, wenn die Muskelfaserform im kontrahierten und entspannten Zustand sowie der Elastizitätsmodul der Matrix bekannt sind25. Nichtsdestotrotz bietet dieses optische System einen einfach zu bedienenden Hochdurchsatzansatz zur Untersuchung der kontraktilen Funktion von Muskeln und eröffnet eine Reihe neuer Möglichkeiten für die Untersuchung genetisch bedingter Muskelerkrankungen und therapeutischer Interventionen.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes und Emmy Manders für ihre technische Expertise bei der Entwicklung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen der Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 to T.J.K), der Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) und des National Health and Medical Research Council (NHMRC, Australien; Fellowship APP1121651 bis M.Y.).
Materials
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
Referanslar
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