Medidas contráteis de alto rendimento de fibras musculares intactas de camundongos embutidas em hidrogel usando um sistema baseado em óptica
Özet
A função muscular esquelética pode ser avaliada pela quantificação da contratilidade de fibras musculares isoladas, tradicionalmente utilizando abordagens trabalhosas e de baixo rendimento. Aqui, descrevemos um método óptico de alto rendimento para quantificar a contratilidade de fibras musculares emblocadas em hidrogel. Essa abordagem tem aplicações na triagem de fármacos e no desenvolvimento terapêutico.
Abstract
A cultura de células in vitro é uma ferramenta poderosa para avaliar processos celulares e testar estratégias terapêuticas. Para o músculo esquelético, as abordagens mais comuns envolvem a diferenciação de células progenitoras miogênicas em miotubos imaturos ou a cultura ex vivo de curto prazo de fibras musculares individuais isoladas. Um dos principais benefícios da cultura ex vivo sobre a in vitro é a retenção da arquitetura celular complexa e das características contráteis. Aqui, detalhamos um protocolo experimental para o isolamento de fibras musculares flexoras curtas intactas de camundongos e sua subsequente cultura ex vivo. Nesse protocolo, as fibras musculares são embutidas em hidrogel à base de fibrina e matriz de membrana basal para imobilizar as fibras e manter sua função contrátil. Em seguida, descrevemos métodos para avaliar a função contrátil da fibra muscular usando um sistema óptico de contratilidade de alto rendimento. As fibras musculares emblocadas são estimuladas eletricamente para induzir contrações, após o que suas propriedades funcionais, como encurtamento do sarcômero e velocidade contrátil, são avaliadas por meio de quantificação óptica. O acoplamento da cultura de fibras musculares com esse sistema permite testes de alto rendimento dos efeitos dos agentes farmacológicos na função contrátil e estudos ex vivo de distúrbios musculares genéticos. Finalmente, este protocolo também pode ser adaptado para estudar processos celulares dinâmicos em fibras musculares usando microscopia de células vivas.
Introduction
Os avanços nas técnicas de cultura de células in vitro abriram novas possibilidades para o estudo da capacidade regenerativa tecidual, dos mecanismos fisiopatológicos celulares e das estratégias terapêuticas subsequentes, utilizando tecidos de mamíferos em condições bem controladas 1,2,3. O uso de sistemas de cultivo in vitro está bem estabelecido no campo da pesquisa muscular 4,5. Em geral, utilizam-se miotubos imaturos diferenciados in vitro a partir de células progenitoras miogênicas 2,6,7,8. Embora tenham sido feitos progressos no protocolo de diferenciação para gerar fibras musculares maismaduras9, sua imaturidade ainda limita a tradução dos achados para um cenário videodan vivo1,10. Uma questão central no campo da biologia muscular é a incapacidade dos miotubos in vitro diferenciados em sintetizar completamente as complexas estruturas intracelulares, processos de sinalização celular e interações extracelulares observadas no tecido muscular nativo e, importante, recapitular as forças contráteis produzidas pelas fibras musculares 1,2,10,11,12 . Além disso, a contração incoordenada dos miotubos durante o processo de diferenciação muitas vezes resulta em descolamento espontâneo das placas de cultura, tornando a avaliação contrátil dos miotubos diferenciados in vitro desafiadora e restrita à avaliação qualitativa ou semiquantitativa8,11,12,13. Essas limitações frequentemente requerem experimentos in vivo regulares com animais, particularmente se a contratilidade muscular for um resultado experimental primário1.
Uma alternativa à cultura em miotubos diferenciados in vitro é a cultura ex vivo de fibras musculares maduras isoladas 1,14. Durante o cultivo ex vivo, o tecido muscular maduro em desenvolvimento é retirado do corpo, seguido de isolamento unicelular para cultivo em condições de laboratório 1,14. As fibras musculares maduras isoladas mantêm suas complexas estruturas celulares observadas no interior do tecido nativo14,15, e esse método abre a possibilidade de intervenções diretas, como manipulação genética e triagem de drogas, em um ambiente de cultura bem definido e controlável. Um dos primeiros relatos sobre isolamento de fibras musculares esqueléticas e cultura ex vivo data da década de 1930; entretanto, o rendimento das fibras viáveis desse protocolo foi baixo16. Com a otimização contínua do procedimento de isolamento e das condições de cultura, é possível uma melhora significativa na quantidade de fibras musculares viáveis e funcionais14,15,17,18,19. Uma dessas melhorias nas condições de cultura envolve o revestimento de placas de cultura com proteínas da matriz extracelular para promover a aderência das fibras musculares isoladas na placa de cultura15,18,20. Usualmente, utiliza-se o revestimento de laminina, uma vez que a laminina é um dos elementos mais abundantes dentro da matriz extracelular dos músculos20,21. A otimização do procedimento de isolamento, aliada ao revestimento das placas de cultura, permitiu ao campo de pesquisa muscular manter isoladas fibras musculares viáveis com arquitetura celular intacta e funcionalidade contrátil em cultura por curtos períodos de tempo 1,15,18,22.
A abordagem mais convencional utilizada dentro do campo muscular para medir a força e as capacidades contráteis é montar fibras musculares individuais entre um motor condutor de comprimento e um transdutor de força23,24. Em geral, as fibras musculares utilizadas para essas montagens motoras são dissecadas a partir de tecido fresco ou congelado por encaixe, seguido de permeabilização ou “skinning”, que permite a ativação externa do cálcio, onde concentrações variáveis de cálcio são usadas para induzir a contração das fibras musculares24. Embora esse método seja o padrão-ouro para medidas contráteis das fibras musculares, apenas uma única fibra muscular pode ser medida por vez, tornando essa técnica um procedimento trabalhoso edemorado25. Além disso, o procedimento de isolamento e esfolamento das fibras musculares rompe as diversas estruturas envolvidas no acoplamento excitação-contração (ou seja, liberação de cálcio e posterior recaptação para o retículo sarcoplasmático), não permitindo o estudo da cinética de relaxamento e de quaisquer doenças que possam afetar esse processo26,27. Uma alternativa ao preparo das fibras esfoladas é o uso da dissecção mecânica para isolar as fibras musculares intactas, onde as forças contráteis podem ser medidas em resposta à ativação elétrica28; no entanto, essa abordagem é tecnicamente desafiadora e muito demorada, resultando em medições de baixo rendimento. Por fim, tanto na preparação esfolada quanto na íntegra, as células musculares são completamente removidas do meio extracelular durante as medidas contráteis 24, impossibilitando a investigação do efeito da composição/rigidez da matriz extracelular na contração das fibras musculares24. Como resultado, o desenvolvimento de métodos alternativos é necessário para permitir medidas de contratilidade das fibras musculares intactas isoladas de uma maneira de alto rendimento, recriando a conexão entre as fibras musculares e a matriz extracelular.
Recentemente, uma nova abordagem óptica para medidas de contratilidade de fibras musculares de alto rendimento foi desenvolvida29. Este sistema óptico mede a periodicidade dos sarcômeros para avaliar o comprimento dos sarcômeros durante a contração usando imagens de alta velocidade. Dentro desse sistema, as células permanecem na placa de cultura enquanto a ótica é movimentada, minimizando o tempo necessário entre as medidas de múltiplas células29. Uma grande vantagem do uso dessa abordagem óptica de alto rendimento é que ela permite o desenvolvimento de condições de cultura semelhantes às do tecido nativo. Uma abordagem utilizada para mimetizar condições nativas in vivo é a incorporação de células em hidrogéis30. Tipicamente, um hidrogel é um material viscoelástico capaz de manter seu volume e forma, e os hidrogéis têm as propriedades de materiais sólidos e líquidos31. A parte sólida consiste em cadeias poliméricas reticuladas entre si, criando uma estrutura que se parece com uma rede30,31. As propriedades materiais dos hidrogéis podem ser ajustadas para mimetizar a deposição da matriz dos músculos30,31. Assim, a combinação de um sistema óptico de alto rendimento com células embutidas em hidrogéis abre novas possibilidades para avaliar os efeitos da composição da matriz extracelular e das propriedades mecânicas sobre a funcionalidade das fibras musculares.
O objetivo geral deste trabalho é 1) descrever a metodologia para o isolamento enzimático e cultura ex vivo de fibras musculares em condições que mimetizam o ambiente do tecido nativo e 2) avaliar a contratilidade das fibras musculares usando uma abordagem de alto rendimento. Descrevemos uma metodologia detalhada para isolar facilmente um grande número de fibras musculares únicas do músculo flexor curto dos dedos (FDB) usando digestão enzimática. Além disso, descrevemos uma técnica para incorporar as fibras musculares isoladas em um hidrogel à base de fibrina com o objetivo de mimetizar o ambiente nativo dos músculos e melhorar a viabilidade e contratilidade das fibras musculares. Em seguida, descrevemos um método de alto rendimento para medir as contrações de fibras musculares vivas in vitro usando este sistema recentemente desenvolvido. Uma vantagem adicional desse procedimento de incorporação é a imobilização das fibras durante a contração, o que pode melhorar a relação sinal-ruído dessas medidas. Este método de incorporação em gel é aplicável tanto para procedimentos de encapsulação de gel monopolimérico quanto compósito, facilitando a avaliação dos efeitos da composição da matriz extracelular na contratilidade das fibras musculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, detalhamos um protocolo para realizar o isolamento enzimático e cultura de fibras musculares FDB em um formato de cultura 3D, seguido de medidas contráteis usando um sistema de medição contrátil baseado em óptica. Este protocolo tem uma série de vantagens, incluindo o 1) isolamento direto e oportuno de muitas fibras musculares intactas de um único músculo; 2) a incorporação das fibras musculares em uma matriz de hidrogel ajustável; 3) a realização de medidas de contratilidade de alto rendimento utilizando o sistema baseado em óptica; e 4) a capacidade de realizar medidas repetidas das mesmas fibras musculares após uma intervenção. O isolamento de fibras musculares vivas únicas fornece células musculares maduras que mantêm sua função contrátil. Como as fibras musculares obtidas do FDB de camundongos são relativamente pequenas, elas são facilmente manipuladas durante o isolamento e mantêm sua forma reta, permitindo medidas contráteis a jusante. Embora o sistema tenha sido desenvolvido primariamente para estudar a contração dos cardiomiócitos, as fibras musculares esqueléticas contêm a mesma maquinaria contrátil com padrões de sarcômeros facilmente distinguíveis e, portanto, também podem ser medidas por meio desse sistema29. O acoplamento de medidas contráteis unicelulares com cultura de fibra muscular viva ex vivo é uma ferramenta poderosa para avaliar a saúde e a função da fibra muscular madura em resposta à ativação elétrica.
Uma limitação do uso de fibras musculares dissociadas é a falta de forças externas (isto é, alongamento passivo) aplicadas às fibras, o que resulta em menores comprimentos de sarcômeros em repouso em comparação com aqueles encontrados in vivo. Embora um comprimento de sarcômero de 2,4-2,5 μm garanta uma produção de força ideal, o comprimento do sarcômero em repouso pode variar muito33. Embora o comprimento do sarcômero em repouso in vivo do FDB ainda não tenha sido descrito, nossos próprios dados não publicados sugerem um comprimento médio de 2,2 μm. Os resultados atuais mostram um comprimento médio do sarcômero em repouso de ~1,95 μm em fibras FDB descarregadas após 24 h em cultura (Figura 3). Embora esse menor comprimento do sarcômero em repouso resulte em menor produção de força, um comprimento de ~1,95 μm ainda deve produzir >90% da força máxima34. Como tal, esses comprimentos de sarcômero devem ser suficientes para determinar diferenças na função da fibra entre diferentes modelos genéticos ou após tratamentos medicamentosos. Além disso, a incorporação de fibras em um hidrogel fornece muitos pontos adicionais para adesão em comparação com fibras cultivadas 2D flutuantes, o que limitaria o encurtamento adicional do sarcômero ao longo do tempo.
Uma vantagem desse protocolo de isolamento das fibras musculares é a utilização de um músculo de contração rápida facilmente dissecado, constituído por fibras musculares relativamente pequenas, quando comparado a outros músculos, como o extensor longo dos dedos (EDL). Seu tamanho menor torna o isolamento muscular mais adequado para a separação baseada em trituração, reduzindo assim a chance de danos induzidos por pipetas ou emaranhados nas fibras musculares. A matriz extracelular dos músculos FDB pode ser facilmente digerida enzimaticamente com colagenase, permitindo o isolamento de centenas de fibras musculares em um curto período de tempo. No entanto, a digestão excessiva pode levar a danos às fibras musculares. A superdigestão das fibras musculares pode ser reconhecida quando o músculo se desfaz quase instantaneamente ao triturar o músculo ou quando uma grande proporção do volume celular é hipercontraída durante o procedimento de semeadura celular. Para evitar a digestão excessiva do músculo, o tempo de digestão precisa ser otimizado para cada lote de colagenase. Para testar isso, dois músculos FDB devem ser digeridos em paralelo com um tempo de digestão escalonado de 5 min entre eles. O tempo de digestão com maior rendimento de fibras musculares viáveis deve ser escolhido. Esta otimização deve então ser realizada uma segunda vez, novamente com 5 min de separação no tempo de digestão. O tempo de digestão que produz as maiores fibras musculares viáveis deve ser usado como o tempo ideal de digestão para o lote atual de colagenase. Outra maneira de limitar a variabilidade lote a lote da colagenase seria calcular diretamente as unidades de atividade por mililitro de solução estoque e, em seguida, reconstituir os lotes subsequentes de colagenase na mesma quantidade. Por fim, os tempos de digestão podem precisar ser otimizados em diferentes linhagens de camundongos, por exemplo, se estudarmos animais idosos ou doentes que apresentam aumento da deposição de matriz extracelular35,36.
A possibilidade de pipetagem de fibras musculares isoladas viáveis abre possibilidades para o cultivo de fibras musculares FDB em diversas condições de cultura. Uma dessas opções é a cultura dessas fibras em hidrogéis para mimetizar o ambiente de cultura de tecidos nativos. Este protocolo de incorporação garante que as fibras permaneçam no lugar durante as medições contráteis e foi otimizado para permitir que as fibras se depositem no fundo da placa antes que o gel se fixe. No entanto, esse protocolo pode precisar ser ajustado para acomodar diferenças nos estoques de trombina e fibrinogênio. Se a atividade da trombina for muito alta, o gel se fixará prematuramente, e as fibras podem ficar suspensas em locais mais altos fora do plano focal do microscópio. Se isso acontecer, a relação trombina:fibrinogênio precisa ser ajustada. Isso pode ser testado plaqueando fibras em concentrações cada vez mais baixas de trombina e anotando quanto tempo leva a polimerização. Normalmente, isso não deve acontecer mais rápido do que 30 min. No entanto, ter uma concentração de trombina muito baixa também pode prejudicar o processo de polimerização. Outro método para garantir que as fibras estejam no plano focal correto é primeiro semeá-las usando um protocolo 2D e, em seguida, adicionar uma camada de hidrogel sobre as fibras depois que elas aderiram à placa de cultura. No entanto, deve-se estar ciente de que a remoção do meio das fibras pode induzir hipercontração, pois elas são sensíveis ao ressecamento. Também não está claro se o hidrogel se fixará totalmente à placa de cultura, e ele pode se soltar mais facilmente. Portanto, esse procedimento de incorporação é preferível para manter as fibras viáveis e no lugar para medidas de contração.
O uso deste protocolo possibilita o estudo da dinâmica contrátil de fibras musculares maduras ex vivo e pode ser aplicado tanto em camundongos sadios quanto naqueles portadores de mutações genéticas para doenças musculares. Da mesma forma, permite testar como as condições de cultura ou a adição de compostos afetam a função das fibras musculares. Os dados contráteis obtidos usando o sistema baseado em óptica fornecem uma indicação da capacidade contrátil de fibras musculares únicas vivas, e mudanças nessa habilidade podem ser correlacionadas com a saúde das fibras. Esses dados, por si só, não são, no entanto, suficientes para determinar se essas alterações ocorrem na ponte cruzada actina-miosina ou nos estágios de liberação de cálcio da contração muscular. Embora não tenhamos descrito métodos para medir a sinalização do cálcio nesse protocolo, essa configuração também é capaz de medir transientes de cálcio à base de Fura em células musculares em contração29. Uma desvantagem desse sistema é que o músculo FDB contém apenas fibras musculares de contração rápida tipo IIa/IIx, e músculos contendo fibras de contração lenta tipo I desse tamanho ainda não foramdescritos37. Isso elimina a capacidade de estudar o funcionamento específico do tipo de fibra usando esse método. O protocolo que propomos aqui poderia ser potencialmente adaptado para outros músculos, como o EDL ou o sóleo, para estudar diferenças de tipo de fibra. Devido ao seu tamanho maior, esse protocolo precisaria ser otimizado ainda mais para esses músculos. Fibras mais longas tendem a se emaranhar durante a etapa de sedimentação por gravidade e se rompem se manipuladas por pipetagem, o que levaria a um menor rendimento. Devido à sua incompatibilidade com a pipetagem, fibras mais longas são, portanto, também menos compatíveis com a técnica de inclusão em gel. As medidas dessas fibras ainda podem ser feitas em formato de cultura 2D, mas as fibras podem se mover mais durante a contração devido ao seu tamanho, afetando a relação sinal-ruído. Outra limitação desse sistema é a incapacidade de realizar medidas de força ao lado das medidas contráteis, como aquelas medidas de força que podem ser obtidas usando outras preparações de fibras musculares intactas28. No entanto, essa limitação pode ser contornada estimando-se a força gerada pela fibra muscular. A força gerada pelas fibras musculares pode ser estimada se a forma da fibra muscular durante os estados contraído e relaxado, bem como o módulo de Young da matriz, são conhecidos25. No entanto, este sistema óptico fornece uma abordagem fácil de usar e de alto rendimento para estudar a função contrátil muscular e abre um leque de novas possibilidades para o estudo de doenças musculares genéticas e intervenções terapêuticas.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Sylvia Bogaards, Sanna Luijcx, Valentijn Jansen, Michiel Helmes e Emmy Manders por sua experiência técnica em ajudar a desenvolver este protocolo. Este trabalho foi apoiado por prêmios da Muscular Dystrophy Association (Development Award MDA603238 to T.J.K), da Dutch Cardiovascular Alliance (Talent Grant to T.J.K) e do National Health and Medical Research Council (NHMRC, Austrália; Fellowship APP1121651 para M.Y).
Materials
| Aprotinin, from Bovine Lung | Thermo Scientific | AAJ63039MC | 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Collagenase type 2 | Worthington | 77336 | 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fibrinogen from Bovine Plasma | Sigma Aldrich | 50-176-5054 | 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413201 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Gibco MEM High glucose + pyruvate | Thermo Fisher | 11095080 | |
| Horse serum | Thermo Fisher | H1270 | |
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230 | 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C. |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Serum Replacement 2 (50x) | Sigma Aldrich | S9388 | |
| Thrombin, Bovine Plasma | Thermo Scientific | AAJ63383EXP | 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Tranexamic Acid | Thermo Scientific | AC228042500 | 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter. |
| Equipment | |||
| 24-well electrical stimulator | IonOptix | N/a | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| MultiCell Cytocypher | IonOptix | N/a | |
| MyoCam-S3 | IonOptix | N/a | |
| MyoPacer | IonOptix | N/a | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent | Dow corning | N/a | |
| Vannas Spring Scissor – 25 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Software | |||
| CytoSolver | IonOptix | N/a | |
| IonWizard | IonOptix | N/a |
Referanslar
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