Een kant-en-klare bevroren voorraad neuronen is een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van synaptische functies. Hier introduceren we een eenvoudige primaire cultuur met lage dichtheid uit bevroren voorraad met behulp van een 96-well plaat.
Neuronale cultuur is een waardevol systeem voor het evalueren van synaptische functies en medicijnscreenings. In het bijzonder maakt een cultuur met lage dichtheid van primaire hippocampale neuronen de studie van individuele neuronen of subcellulaire componenten mogelijk. We hebben subcellulaire eiwitlokalisatie binnen een neuron aangetoond door immunocytochemie, neuronale polariteit, synaptische morfologie en de ontwikkelingsverandering ervan met behulp van een primaire hippocampuscultuur met lage dichtheid. Onlangs zijn kant-en-klare bevroren voorraden neuronen commercieel beschikbaar geworden. Deze bevroren voorraden neuronen verminderen de tijd die nodig is om dierproeven voor te bereiden en dragen ook bij aan de vermindering van het aantal gebruikte dieren. Hier introduceren we een reproduceerbare primaire kweekmethode met lage dichtheid met behulp van een 96-well plaat. We gebruikten een in de handel verkrijgbare bevroren voorraad neuronen van de rat embryonale hippocampus. De neuronen kunnen op lange termijn stabiel worden gekweekt zonder mediaveranderingen door de groei van gliacellen op bepaalde tijdstippen te verminderen. Deze high-throughput assay met behulp van low-density cultuur maakt reproduceerbare imaging-gebaseerde evaluaties van synaptische plasticiteit mogelijk.
De ontwikkeling van een in vitro experimenteel systeem dat synaptische functies kan beoordelen die betrokken zijn bij leren en geheugen is belangrijk. Neuronale cultuur is een waardevol systeem voor het evalueren van synaptische functies in vitro. De neuronale kweektechniek werd voor het eerst gebruikt in de jaren 1980 en in de jaren 1990 werd een cultuur met lage dichtheid van primaire hippocampusneuronen ontwikkeld 1,2,3 voor de studie van individuele neuronen in termen van subcellulaire lokalisatie van eiwitcomponenten, eiwithandel, neuronale polariteit, morfologie van de wervelkolom, synapsontwikkeling en plasticiteit 4,5,6,7,8 . Er zijn echter veel stappen betrokken bij deze techniek: het paren van dieren, het ontleden van embryo’s, het voorbereiden van kweekvaten en het kweken van cellen gedurende 3 weken met mediaveranderingen eenmaal per week. Bovendien vereist het geavanceerde technieken3.
We hebben bevroren voorraden van gedissocieerde hippocampusneuronen ontwikkeld van rattenembryo’s 9,10. De bevroren voorraden neuronen zijn klaar voor gebruik en er zijn geen geavanceerde technieken nodig voor het kweken van de cellen11,12. Met andere woorden, het kweken van de neuronen uit bevroren voorraden is niet afhankelijk van de techniek van een experimentator. Het elimineert de noodzaak van dierproeven (bijvoorbeeld toestemming voor dierproeven, het regelen van getimede drachtige dieren en het ontleden van rattenembryo’s), waardoor het aantal gebruikte dieren wordt verminderd. Onlangs zijn hoogwaardige, kant-en-klare bevroren voorraden neuronen commercieel beschikbaar geworden. Hier gebruikten we commercieel verkrijgbare diepvriesvoorraden vanaf de embryonale dag (E) 18 rat hippocampus 13,14,15. Het kweken van de neuronen uit een bevroren voorraad vereist geen glia-geconditioneerde media of co-kweek met gliacellen. Gewone primaire kweekmedia zonder extra serum kunnen worden gebruikt om de cellen te kweken; zo kunnen we reproduceerbare gegevens verkrijgen. Bovendien is er gedurende 3 weken na het zaaien van de cel geen behoefte aan media-uitwisseling, omdat de groei van gliacellen wordt verminderd (figuur 1).
Dendritische stekels zijn het postsynaptische compartiment van de meeste exciterende synapsen. Ze bevatten receptoreiwitten, postsynaptische steigereiwitten en actinecytoskeletale eiwitten. We concentreerden ons op een actinebindend eiwit drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin hoopt zich op aan het hoofd van de wervelkolom in volwassen neuronen19, en we rapporteerden drebrin als een marker voor de synaptische toestand 15,17,20,21,22,23. Door een analyse met een hoog gehalte uit te voeren met drebrin als uitlezing, hebben we onlangs de remmende effecten van fencyclidine-analogen op N-methyl-D-asparaginezuur-type glutamaatreceptoren (NMDARs)10 en de NMDAR-afhankelijke effecten van natuurlijke verbindingen en ruwe geneesmiddelen op synaptische toestandengemeld 15.
Hier beschrijven we hoe bevroren voorraden neuronen met een lage dichtheid kunnen worden gekweekt. Daarnaast tonen we een op drebrin imaging gebaseerde evaluatie van de synaptische toestand met behulp van 96-well platen.
Een cruciale stap in deze methode is het ontdooien van de celsuspensie. Overdracht van de celsuspensie voordat deze te warm wordt, is erg belangrijk. Om de snelle verandering van osmolaliteit te voorkomen, moet u de celsuspensie echter niet in één keer overbrengen naar een groot volume van het medium. Druppelsgewijze toevoeging van het kweekmedium is ook cruciaal om plotselinge veranderingen in osmotische druk te voorkomen.
De neuronen kunnen worden gekweekt in andere kweekvaten: 24-well platen, 8-well kamers, 60 mm schotels of MED-sondes. In die gevallen moeten echter de uiteindelijke concentratie en het tijdstip van de toevoeging van Ara-C worden aangepast. Bovendien moet de dichtheid van neuronen worden geoptimaliseerd in verschillende soorten experimenten. Voor elektrofysiologische experimenten is bijvoorbeeld een cultuur met hoge dichtheid vereist en in dat geval is de media-uitwisseling twee keer per week nodig (figuur 6). Een cultuur met een lage dichtheid vereist dus minder stappen dan een cultuur met een hoge dichtheid.
Neuronale cultuur met lage dichtheid vereist vaak geavanceerde technieken; het gebruik van kant-en-klare bevroren voorraad lost dit probleem echter op. De beschreven methode is niet afhankelijk van de vaardigheid van een experimentator. De kwaliteit van bevroren voorraad is stabiel en kan stabiel worden gekweekt zolang ze worden opgeslagen in vloeibare stikstof en temperatuurveranderingen tot 4 jaar vermijden.
Het kweken van de cellen gedurende 3 weken zonder medium uitwisseling roept de vraag op of er significante osmolaliteitsveranderingen of cultuurmediaverdamping zijn. We hebben echter bevestigd dat de verdamping van de cultuurmedia klein is (reductiepercentage van 3,6%). De lokalisatie van synaptische eiwitten en de morfologie van de neuronen lijken na 3 weken normaal. Daarom veroorzaakt een cultuur van 3 weken zonder media-uitwisseling geen grote osmolaliteitsveranderingen die de omstandigheden van de gekweekte neuronen beïnvloeden. Het bewaren van de plaat in een couveuse na ara-c behandeling is ook een belangrijk punt dat verdamping minimaliseert.
Er is geen beperking met betrekking tot het gebruik van de bevroren voorraadneuronen. Er zijn echter enkele beperkingen van de cultuurmethode met lage dichtheid. We bevestigden dat de lage-dichtheidscultuur kon worden toegepast voor morfologische observatie van neuronen, evaluatie van synaptische functie en GFP-transfectie. We hebben echter geen live cell imaging onderzocht. Bovendien is, zoals hierboven vermeld, cultuur met hoge dichtheid vereist om elektrofysiologie uit te voeren.
Synapsrijping duurt meestal 3 weken7, en we kunnen niet bevestigen dat de gekweekte neuronen tot het einde de juiste synapsen hebben. Als de synapsrijping na 3 weken niet goed is, zouden we opnieuw moeten kweken. Door de kwaliteit van de neuronen te kennen voordat we met de experimenten beginnen, kunnen we deze 3 weken besparen. Daarom, om experimenten efficiënt uit te voeren, is het het beste om de kwaliteit van de neuronen van tevoren te controleren. Bevroren voorraden maken het mogelijk om vooraf de kwaliteit van de neuronen te controleren. Elke partij bevroren voorraden wordt gegenereerd uit één nest ratten en we kunnen een van de voorraden van elke batch gebruiken voor een kwaliteitscontrole. Drebrin is een goede marker voor de kwaliteitscontrole van de neuronen. Zoals beschreven, hoopt drebrine zich op in het hoofd van de wervelkolom in volwassen neuronen en reageert het op synaptische stimulatie. Zo kunnen we de kwaliteit van de neuronen in bevroren voorraden controleren door drebrin als marker te gebruiken.
Deze methode kan worden toegepast om het effect van geneesmiddelen op de synaptische toestand te evalueren. De uittocht van drebrin uit dendritische stekels vindt plaats tijdens de beginfase van synaptische plasticiteit22. Daarom toont de detectie van drebrineclusterreductie veroorzaakt door medicamenteuze behandeling aan dat het medicijn de synaps stimuleert en synaptische plasticiteit veroorzaakt. Om te bepalen of de reductie NMDAR-afhankelijk is, is bovendien een experiment met 2-amino-5-fosfonovalerzuur (APV, een NMDAR-antagonist) nuttig. Met drebrin als marker wordt zelfs een NMDAR-afhankelijkheid duidelijk bepaald10,15. De beschreven methode is nuttig bij geneesmiddelenscreenings, veiligheidsfarmacologische studies en evaluatie van de synaptische functie.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Kazumi Kamiyama en Manami Kawada voor hun hulp bij experimenten. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant Number 19K08010 to N.K.) en Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Grant Number JP19bk0104077 en JP22bm0804024 to T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |