يعد المخزون المجمد الجاهز للاستخدام من الخلايا العصبية أداة قوية لتقييم الوظائف المشبكية. هنا ، نقدم استزراع أولي سهل منخفض الكثافة من المخزون المجمد باستخدام لوحة 96 بئر.
الثقافة العصبية هي نظام قيم لتقييم الوظائف المشبكية وفحوصات الأدوية. على وجه الخصوص ، تسمح الثقافة منخفضة الكثافة للخلايا العصبية الحصينية الأولية بدراسة الخلايا العصبية الفردية أو المكونات تحت الخلوية. لقد أظهرنا توطين البروتين تحت الخلوي داخل الخلية العصبية عن طريق الكيمياء المناعية ، والقطبية العصبية ، والتشكل المشبكي ، وتغيره التنموي باستخدام ثقافة الحصين الأولية منخفضة الكثافة. في الآونة الأخيرة ، أصبحت المخزونات المجمدة الجاهزة للاستخدام من الخلايا العصبية متاحة تجاريا. هذه المخزونات المجمدة من الخلايا العصبية تقلل من الوقت اللازم لإعداد التجارب على الحيوانات وتساهم أيضا في تقليل عدد الحيوانات المستخدمة. هنا ، نقدم طريقة استزراع أولية منخفضة الكثافة قابلة للتكرار باستخدام لوحة 96 بئرا. استخدمنا مخزونا مجمدا متاحا تجاريا من الخلايا العصبية من الحصين الجنيني للفئران. يمكن استزراع الخلايا العصبية بشكل مستقر على المدى الطويل دون تغييرات في الوسائط عن طريق تقليل نمو الخلايا الدبقية في نقاط زمنية معينة. يسمح هذا الفحص عالي الإنتاجية باستخدام ثقافة منخفضة الكثافة بإجراء تقييمات قائمة على التصوير قابلة للتكرار للدونة المشبكية.
من المهم تطوير نظام تجريبي في المختبر يمكنه تقييم الوظائف المشبكية المشاركة في التعلم والذاكرة. الثقافة العصبية هي نظام قيم لتقييم الوظائف المشبكية في المختبر. تم استخدام تقنية الثقافة العصبية لأول مرة في 1980s ، وفي 1990s ، تم تطوير ثقافة منخفضة الكثافة من الخلايا العصبية الحصين الأولية1،2،3 لدراسة الخلايا العصبية الفردية من حيث توطين تحت الخلايا لمكونات البروتين ، والاتجار بالبروتين ، وقطبية الخلايا العصبية ، ومورفولوجيا العمود الفقري ، وتطوير المشبك ، واللدونة4،5،6،7،8 . ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات التي تنطوي عليها هذه التقنية: تزاوج الحيوانات ، وتشريح الأجنة ، وإعداد أوعية الاستزراع ، وزراعة الخلايا لمدة 3 أسابيع مع تغييرات الوسائط مرة واحدة في الأسبوع. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتطلب تقنيات متقدمة3.
لقد طورنا مخزونا مجمدا من الخلايا العصبية الحصين المنفصلة من أجنة الفئران 9,10. المخزونات المجمدة من الخلايا العصبية جاهزة للاستخدام ، ولا يلزم تقنيات متقدمة لزراعة الخلايا11,12. بمعنى آخر ، لا يعتمد زراعة الخلايا العصبية من المخزونات المجمدة على تقنية المجرب. إنه يلغي الحاجة إلى التجارب على الحيوانات (على سبيل المثال ، إذن التجارب على الحيوانات ، وترتيب الحيوانات الحامل الموقوتة ، وتشريح أجنة الفئران) ، وبالتالي تقليل عدد الحيوانات المستخدمة. في الآونة الأخيرة ، أصبحت مخزونات الخلايا العصبية المجمدة عالية الجودة والجاهزة للاستخدام متاحة تجاريا. هنا ، استخدمنا المخزونات المجمدة المتاحة تجاريا من اليوم الجنيني (E) 18 قرن آمونالفئران 13،14،15. لا يتطلب استزراع الخلايا العصبية من مخزون مجمد وسائط مكيفة مع الخلايا الدبقية أو زراعة مشتركة مع الخلايا الدبقية. يمكن استخدام وسائط الثقافة الأولية العادية بدون مصل إضافي لزراعة الخلايا. ومن ثم يمكننا الحصول على بيانات قابلة للتكرار. علاوة على ذلك ، ليست هناك حاجة لتبادل الوسائط لمدة 3 أسابيع بعد بذر الخلية حيث يتم تقليل نمو الخلايا الدبقية (الشكل 1).
العمود الفقري الشجيري هو المقصورة بعد المشبكية لمعظم نقاط الاشتباك العصبي المثيرة. أنها تحتوي على بروتينات مستقبلات ، وبروتينات سقالة ما بعد المشبكي ، وبروتينات الأكتين الخلوي الهيكلي. ركزنا على بروتين دريبرين المرتبط بالأكتين5،6،7،16،17،18. يتراكم Drebrin عند رأس العمود الفقري في الخلايا العصبية الناضجة19 ، وأبلغنا عن drebrin كعلامة للحالة المشبكية15،17،20،21،22،23. من خلال إجراء تحليل عالي المحتوى باستخدام drebrin كقراءات ، أبلغنا مؤخرا عن التأثيرات المثبطة لنظائر phencyclidine على مستقبلات الغلوتامات من نوع حمض N-methyl-D-aspartic (NMDARs)10 والتأثيرات المعتمدة على NMDAR للمركبات الطبيعية والأدوية الخام على الحالات المشبكية15.
هنا ، نوضح بالتفصيل كيفية زراعة المخزونات المجمدة من الخلايا العصبية بكثافة منخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، نعرض تقييما قائما على التصوير drebrin للحالة المشبكية باستخدام 96 لوحة بئر.
الخطوة الحاسمة في هذه الطريقة هي إذابة تعليق الخلية. نقل تعليق الخلية قبل أن يصبح دافئا جدا مهم جدا. لتجنب التغيير السريع للأسمولية ، لا تنقل تعليق الخلية إلى حجم كبير من الوسط مرة واحدة. تعد إضافة وسط الاستزراع أمرا بالغ الأهمية أيضا لتجنب التغيرات المفاجئة في الضغط التناضحي.
يمكن استزراع الخلايا العصبية في أوعية استزراع أخرى: 24 لوحة بئر ، أو غرف ذات 8 آبار ، أو أطباق 60 مم ، أو مجسات MED. ومع ذلك ، في هذه الحالات ، يجب تعديل التركيز النهائي وتوقيت إضافة Ara-C. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحسين كثافة الخلايا العصبية في أنواع مختلفة من التجارب. على سبيل المثال ، الثقافة عالية الكثافة مطلوبة لتجارب الفيزيولوجيا الكهربية ، وفي هذه الحالة ، هناك حاجة إلى تبادل الوسائط مرتين في الأسبوع (الشكل 6). وبالتالي ، تتطلب الثقافة منخفضة الكثافة خطوات أقل من الثقافة عالية الكثافة.
غالبا ما تتطلب الثقافة العصبية منخفضة الكثافة تقنيات متقدمة. ومع ذلك ، فإن استخدام المخزون المجمد الجاهز للاستخدام يحل هذه المشكلة. الطريقة الموصوفة لا تعتمد على مهارة المجرب. جودة المخزون المجمد مستقرة ويمكن استزراعه بثبات طالما يتم تخزينه في النيتروجين السائل وتجنب التغيرات في درجات الحرارة لمدة تصل إلى 4 سنوات.
يثير استزراع الخلايا لمدة 3 أسابيع دون تبادل متوسط السؤال حول ما إذا كانت هناك تغييرات كبيرة في الأسمولية أو تبخر وسائط الثقافة. ومع ذلك ، فقد أكدنا أن تبخر الوسائط الثقافية صغير (معدل تخفيض 3.6٪). توطين البروتينات المشبكية ومورفولوجيا الخلايا العصبية تبدو طبيعية بعد 3 أسابيع. لذلك ، لا تسبب الثقافة لمدة 3 أسابيع دون تبادل الوسائط تغيرات أسمولية كبيرة تؤثر على ظروف الخلايا العصبية المزروعة. يعد الاحتفاظ باللوحة في حاضنة بعد علاج Ara-C أيضا نقطة مهمة تقلل من التبخر.
لا توجد قيود فيما يتعلق باستخدام الخلايا العصبية المجمدة. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على طريقة الاستزراع منخفض الكثافة. أكدنا أنه يمكن تطبيق الثقافة منخفضة الكثافة للمراقبة المورفولوجية للخلايا العصبية ، وتقييم الوظيفة المشبكية ، ونقل GFP. ومع ذلك ، لم نفحص تصوير الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، كما ذكر أعلاه ، مطلوب ثقافة عالية الكثافة لأداء الفيزيولوجيا الكهربية.
عادة ما يستغرق نضوج المشبك العصبي 3 أسابيع7 ، ولا يمكننا تأكيد أن الخلايا العصبية المستزرعة لديها نقاط اشتباك عصبي مناسبة حتى النهاية. إذا لم يكن نضوج المشبك جيدا بعد 3 أسابيع ، فسيتعين علينا الثقافة مرة أخرى. من خلال معرفة جودة الخلايا العصبية قبل بدء التجارب ، يمكننا توفير هذه الأسابيع 3. لذلك ، لإجراء التجارب بكفاءة ، من الأفضل التحقق من جودة الخلايا العصبية مقدما. المخزونات المجمدة تجعل من الممكن التحقق من جودة الخلايا العصبية مسبقا. يتم إنشاء كل دفعة من المخزونات المجمدة من فضلات الفئران ، ويمكننا استخدام أحد المخزونات من كل دفعة لفحص الجودة. Drebrin هو علامة جيدة لفحص جودة الخلايا العصبية. كما هو موضح ، يتراكم drebrin في رأس العمود الفقري في الخلايا العصبية الناضجة ، ويتفاعل مع التحفيز المشبكي. وبالتالي ، يمكننا التحقق من جودة الخلايا العصبية في المخزونات المجمدة باستخدام drebrin كعلامة.
يمكن تطبيق هذه الطريقة لتقييم تأثير الأدوية على الحالة المشبكية. يحدث نزوح drebrin من العمود الفقري التغصني خلال المراحل الأولية من اللدونة المشبكية22. لذلك ، فإن الكشف عن الحد من مجموعة drebrin الناجم عن العلاج بالعقاقير يظهر أن الدواء يحفز المشبك ويسبب اللدونة المشبكية. علاوة على ذلك ، لتحديد ما إذا كان التخفيض يعتمد على NMDAR ، من المفيد إجراء تجربة باستخدام حمض 2-amino-5-phosphonovaleric (APV ، مضاد NMDAR). باستخدام drebrin كعلامة ، حتى تبعية NMDAR يتم تحديدها بوضوح10,15. الطريقة الموصوفة مفيدة في فحوصات الأدوية ، والدراسات الدوائية للسلامة ، وتقييم الوظيفة المشبكية.
The authors have nothing to disclose.
نشكر كازومي كامياما ومانامي كاوادا على المساعدة في التجارب. تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة 19K08010 إلى N.K.) والوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) (رقم المنحة JP19bk0104077 و JP22bm0804024 إلى T.S.).
96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
96 well plate | greiner | 655986 | |
Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |